探討納米級(jí)中藥黃芪對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群失調(diào)的調(diào)整作用

孫立群 梁金花 高月娟

（牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）為病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確的大腸黏膜慢性非特異性炎癥，是以腹瀉、黏液膿血便、腹痛和里急后重為主要癥狀，以結(jié)腸黏膜慢性炎癥和潰瘍?yōu)椴±硖攸c(diǎn)的一種消化道疾病。近年來(lái)其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。臨床常用柳氮磺胺吡啶（SASP）和糖皮質(zhì)激素進(jìn)行治療，但副作用大且容易復(fù)發(fā)［1-2］。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)部分補(bǔ)益類中藥具有扶植腸道正常菌群生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)菌群失調(diào)，提高定植抗力功能，可起到益生元作用的機(jī)理，選取納米級(jí)黃芪作為治療藥物，從微生態(tài)學(xué)角度探討其對(duì)UC大鼠腸道菌群失調(diào)的調(diào)整作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠60只，體質(zhì)量 180～220 g，雌雄各半，由牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試劑乙酸﹑丙酸﹑丁酸﹑異丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司），麗珠腸樂（珠海麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠），培養(yǎng)基（青島海博生物有限公司），2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（Sigma 公司）。

1.3 納米級(jí)黃芪（1）制備：將常態(tài)黃芪剪碎，60℃下24 h烘干，常規(guī)粉碎，加入適量蒸餾水，然后應(yīng)用球磨機(jī)磨48 h進(jìn)行納米化，制成納米中藥，生藥質(zhì)量濃度為0.2 g/mL。4℃保存，給藥前復(fù)溫至25～30℃。（2）鑒定：將球磨法制備的中藥稀釋到一定濃度，超聲分散，透射電鏡觀察，藥物粒徑在100 nm以下。

1.4 分組與造模60只大鼠隨機(jī)分為模型組（10只），正常組（20 只），自然恢復(fù)組（10 只），麗珠腸樂組（10 只），納米黃芪組（10只）。除正常組外，其余各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.2 mL/100 g）麻醉，固定。將外徑2.0 mm、長(zhǎng)約15 cm左右的輸液管（輸液管先用液體石蠟油潤(rùn)滑），從大鼠肛門逆行插入結(jié)腸內(nèi)深約8.0 cm處，一次性將含100 mg/kg TNBS和50%乙醇的TNBS-乙醇液0.25 mL注入結(jié)腸內(nèi)，用棉簽堵住肛門，輕揉腹部1 min，使TNBS-乙醇液均勻地與結(jié)腸黏膜接觸。然后將大鼠頭向下，身體傾斜45°，放置1 min，再將大鼠放平。對(duì)照組采用同樣方法，0.25 mL 0.9%氯化鈉注射液灌腸，均自然清醒。3 d后，處死模型組大鼠和10只正常組大鼠，剪取直腸和結(jié)腸組織，清洗后肉眼觀察結(jié)腸組織，并取腸段（10%甲醛溶液中固定）作組織切片以確定造模是否成功。

1.5 給藥方法納米黃芪組采用納米黃芪進(jìn)行灌胃治療，麗珠腸樂組用麗珠腸樂灌胃治療，自然恢復(fù)和正常組用0.9%氯化鈉注射液灌胃，以上各組灌胃量均為每次0.3 mL，每日兩次，連續(xù)7 d后處死進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.6.1 腸道菌群檢測(cè) 在距大鼠回盲部末端10 cm以內(nèi)，無(wú)菌采取盲腸內(nèi)容物0.1 g，用無(wú)菌0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行10倍系列稀釋至10～9倍。不同稀釋度標(biāo)本滴種培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.6.2 氣象色譜分析技術(shù)檢測(cè)脂肪酸含量 無(wú)菌條件下取0.05g盲腸內(nèi)容物，立即放入無(wú)菌玻璃試管中，溶于1 mL蒸餾水中，加50%硫酸0.1 mL、乙醚0.5 mL，蓋緊塞子，來(lái)回倒轉(zhuǎn)20次，使乙醚和培養(yǎng)物充分混勻，1000 r/min離心10 min，置試管于-20℃冰箱至試管底部水結(jié)冰，迅速倒出乙醚于另一試管，取1 μL作色譜分析。將樣本注入進(jìn)樣器后，儀器自動(dòng)采集數(shù)據(jù)并送到1200工作站積分處理并作出色譜圖，其中記錄各有機(jī)酸的出峰順序、保留時(shí)間、峰高、峰面積百分比。

1.6.3 肝臟細(xì)菌易位檢測(cè) 將大鼠在無(wú)菌條件下取肝組織0.1 g，置于無(wú)菌勻漿器中，加0.9 mL 0.9%氯化鈉注射液勻漿，將標(biāo)本稀釋至10-3，用微量加樣器吸取標(biāo)本20 μL滴種在中國(guó)蘭培養(yǎng)基上，置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)采用（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成模情況模型組肉眼觀顯示結(jié)腸黏膜充血、水腫、糜爛、出血、潰瘍；顯微鏡下顯示隱窩有急性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，固有膜內(nèi)有慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。正常組大鼠結(jié)腸黏膜組織肉眼觀和顯微鏡下均顯示正常。

2.2 傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)腸道菌群的變化見表1。與正常組相比，模型組雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量明顯下降，腸桿菌和腸球菌數(shù)量顯著上升，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。納米黃芪組與麗珠腸樂組雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量均明顯上升，腸球菌和腸桿菌的數(shù)量明顯下降，相比自然恢復(fù)組具有顯著差異 （P＜0.05），納米黃芪組與麗珠腸樂組之間的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明納米黃芪對(duì)腸道微生態(tài)失調(diào)的調(diào)整作用優(yōu)于麗珠腸樂。

表1 各組大鼠腸道菌群定量檢測(cè)結(jié)果比較（lgN／g，±s）

表1 各組大鼠腸道菌群定量檢測(cè)結(jié)果比較（lgN／g，±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與納米黃芪組比較，△P＜0.05；與自然恢復(fù)組比較，▲P＜0.05。下同。

組 別 n 雙歧桿菌 乳酸桿菌 腸桿菌 腸球菌模型組 8 8.14±0.61* 7.46±0.41* 10.01±0.71* 10.02±0.59*正常組 9 10.22±0.28 10.05±0.50 6.83±0.47 7.18±0.02納米黃芪組 9 10.36±0.38▲ 10.16±0.43▲ 7.23±0.18▲ 6.73±0.50▲麗珠腸樂組 9 10.02±0.37▲△ 9.02±0.31▲△ 8.19±0.35▲△ 7.64±0.29▲△自然恢復(fù)組 8 9.04±0.06 8.17±0.26 9.89±0.67 9.27±0.04

2.3 各組乙酸含量比較見表2。與正常組相比，模型組乙酸含量顯著下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。納米黃芪組與麗珠腸樂組乙酸含量顯著明顯上升，與自然恢復(fù)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 各組肝臟細(xì)菌易位檢測(cè)結(jié)果見表3。與正常組相比，模型組腸桿菌數(shù)量明顯上升（P＜0.05）。納米黃芪組與麗珠腸樂組腸桿菌數(shù)量顯著上升下降，相比自然恢復(fù)組具有顯著差異 （P＜0.05），納米黃芪組與麗珠腸樂組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），納米黃芪組降低腸桿菌易位的作用優(yōu)于麗珠腸樂組。

表2 各組乙酸含量比較（mg/mL，x±s）

表3 各肝臟細(xì)菌易位檢測(cè)結(jié)果比較（lgN／g，x±s）

3 討 論

機(jī)體與其正常菌群作為一個(gè)整體存在，它們既相互依賴又相互制約。納米中藥黃芪對(duì)雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量的升高具有明顯促進(jìn)作用，可以降低腸桿菌、腸球菌的數(shù)量。可見納米中藥黃芪可以顯著改善腸道微生態(tài)失調(diào)［3-9］。

大鼠腸道微生態(tài)失調(diào)后，厭氧菌代謝產(chǎn)物乙酸的含量顯著下降，經(jīng)7 d的藥物治療，大鼠腸道菌群失調(diào)得到調(diào)整，腸道內(nèi)厭氧菌的數(shù)量上升，同時(shí)厭氧菌代謝產(chǎn)物乙酸的含量也迅速上升。

經(jīng)過(guò)7 d治療，大鼠肝臟細(xì)菌易位數(shù)量大幅度下降，與同時(shí)期自然恢復(fù)組相比，差異有極顯著性，說(shuō)明納米中藥黃芪能有效控制肝臟的需氧菌易位。其機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬能力和機(jī)體免疫力來(lái)完成的。

納米中藥黃芪與麗珠腸樂對(duì)微生態(tài)失調(diào)大鼠均具有調(diào)整菌群失調(diào)的作用，但從檢測(cè)指標(biāo)的結(jié)果比較中可以看出納米黃芪的作用優(yōu)于麗珠腸樂（活菌制劑）。其原因可能與中藥雙向性調(diào)節(jié)有關(guān)。扶正固本類中藥不僅具有良好的扶植正常菌群的作用，而且具有提高機(jī)體免疫力的效果［10］。

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