高糖對(duì)小鼠足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)作用及機(jī)制探討

劉青娟，張玉軍，李建英，付曉輝，姚 芳，吳海江，邢玲玲

(1河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室，石家莊050017;2石家莊市人民醫(yī)院;3河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院)

近年研究顯示，糖尿病腎病(DN)時(shí)高糖環(huán)境、糖基化終產(chǎn)物、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、氧自由基、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血管緊張素Ⅱ和機(jī)械應(yīng)力的增加都可以損傷足細(xì)胞，而足細(xì)胞的損傷與蛋白尿的產(chǎn)生關(guān)系密切，在DN發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［1～4］。有研究［5，6］顯示，與腎近端小管上皮細(xì)胞類似，足細(xì)胞亦可在病理因素刺激下發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，即上皮向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)，從而脫離基底膜，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)屏障發(fā)生障礙引起蛋白尿，但有關(guān)足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究較少。近年來(lái)，我們的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在糖尿病動(dòng)物及高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞中，JAK/STAT信號(hào)通路的活性明顯增強(qiáng)，且該通路的激活與腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化有關(guān)。由此我們推測(cè)，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化或許也與JAK/STAT通路有關(guān)。2010年9月～2011年10月，我們應(yīng)用蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(JAK2)的特異性阻斷劑 α-氰-(3，4-二羥基)-N-芐基肉桂酰胺(AG490)干預(yù)足細(xì)胞，觀察足細(xì)胞自身標(biāo)志物人腎病蛋白(Nephrin)和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的變化，探討高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠足細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心;兔抗Nephrin、α-SMA、β-actin多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森公司，兔抗p-JAK2抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;AG490購(gòu)自美國(guó)Calbiochem公司;逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑為Promega公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將凍存的足細(xì)胞復(fù)蘇后，置于含 10 U/mL γ-干擾素和 10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中，33℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);傳代后轉(zhuǎn)入不含γ-干擾素的培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)10～14 d，使足細(xì)胞充分分化后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前換無(wú)血清培養(yǎng)基孵育12 h，使細(xì)胞同步化。將細(xì)胞隨機(jī)分為A、B、C三組，A組常規(guī)培養(yǎng)不處理，B組加入終濃度為30 mmol/L的葡萄糖，C組加入終濃度為30 mmol/L的葡萄糖及10 μmol/L的 AG490。

1.2.2 足細(xì)胞中Nephrin、α-SMA和p-JAK2蛋白的檢測(cè) 采用Western blot法。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，－70℃保存。每個(gè)樣品取50 μg總蛋白，10%SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，再分別加入兔抗p-JAK2、α-SMA 多克隆抗體(1∶500稀釋)，4 ℃過(guò)夜。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，以 β-actin作為內(nèi)參照。Western blot條帶信號(hào)強(qiáng)度采用Lab Work 45圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，測(cè)定各條帶的積分光密度值(IOD)，以此表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。

1.2.3 足細(xì)胞中 Nephrin、α-SMA mRNA 的檢測(cè)采用RT-PCR法。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度儀測(cè)定其濃度后，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。18 S rRNA的上下游引物分別為5'-ACA CGG ACA GGA TTG ACA GA-3'、5'-GGA CAT CTA AGG GCA TCA CAG-3'(238 bp)，α-SMA的上下游引物分別為5'-CTG AAG AGC ATC CGA CAC-3'、5'-GAC TCC ATC CCA ATG AAA G-3'(520 bp)，Nephrin的上下游引物分別為 5'-CCC CAA CAT CGA CTT CAC TT-3'、5'-GGC AGG ACA TCC ATG TAG AG-3'(372 bp)。所用引物均由上海捷銳生物公司合成。將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后置于凝膠圖像分析系統(tǒng)(UVP公司，美國(guó))進(jìn)行吸光度掃描，以18 S rRNA作為內(nèi)參照校正，用目的基因的吸光度與18 S rRNA吸光度的比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。所得數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組足細(xì)胞中 Nephrin、α-SMA、p-JAK2 蛋白的表達(dá)量比較 見(jiàn)表1。

表1 各組足細(xì)胞中Nephrin、α-SMA、p-JAK2蛋白表達(dá)量比較(±s)

表1 各組足細(xì)胞中Nephrin、α-SMA、p-JAK2蛋白表達(dá)量比較(±s)

注:與 A組比較，*P ＜0.05;與 B 組比較，#P ＜0.05

組別 Nephrin α-SMA p-JAK2 A組0.96±0.01 0.21±0.02 0.39±0.01 B 組 0.58±0.01* 0.66±0.07* 0.71±0.02*C 組 0.87±0.04# 0.35±0.02# 0.41±0.04#

2.2 各組足細(xì)胞中Nephrin、α-SMA mRNA的表達(dá)量比較 見(jiàn)表2。

表2 各組足細(xì)胞中Nephrin、α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表2 各組足細(xì)胞中Nephrin、α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注:與 A組比較，*P ＜0.05;與 B 組比較，#P ＜0.05

組別 Nephrin mRNA α-SMA mRNA A組1.53±0.04 0.57±0.01 B 組 0.82±0.09* 0.89±0.03*C 組 1.30±0.04# 0.78±0.03#

3 討論

腎臟纖維化是各種慢性腎臟疾病的最終結(jié)局，隨著糖尿病發(fā)病率的上升，DN逐漸成為導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一。肌成纖維細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源，在腎臟纖維化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。正常腎組織中幾乎無(wú)肌成纖維細(xì)胞。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，EMT是肌成纖維細(xì)胞的主要來(lái)源。以往的研究更關(guān)注腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，而足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞均來(lái)源于胚胎中胚層的間葉細(xì)胞，因此考慮足細(xì)胞和小管上皮細(xì)胞一樣，在病理?xiàng)l件下具有轉(zhuǎn)分化為間葉細(xì)胞的可能性［1］。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究［5～8］表明，在某些病理因素作用下，腎小球足細(xì)胞確實(shí)也可發(fā)生EMT，即喪失其特異性標(biāo)志物，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)分化的特征，從而在腎小球?yàn)V過(guò)屏障受損、蛋白尿及腎小球硬化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。DN發(fā)病過(guò)程中伴隨有明顯的足細(xì)胞形態(tài)和功能異常，考慮足細(xì)胞EMT是其中的關(guān)鍵病理過(guò)程［6］。α-SMA是普遍公認(rèn)的一種提示上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的標(biāo)志性蛋白之一。在生理?xiàng)l件下，足細(xì)胞不表達(dá)α-SMA，其在足細(xì)胞中的表達(dá)可作為足細(xì)胞發(fā)生EMT的一個(gè)有價(jià)值的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與A組相比，B組在高糖刺激下可使足細(xì)胞Nephrin的表達(dá)減少而α-SMA表達(dá)增加，提示高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。

足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化后可獲得分泌功能，使細(xì)胞外基質(zhì)分泌過(guò)多，從而導(dǎo)致腎小球硬化并最終發(fā)展至纖維化［9］。逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞功能損傷可延緩或減輕DN的進(jìn)展［10］。因此，探討足細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制，并進(jìn)一步阻斷該過(guò)程至關(guān)重要。JAK/STAT信號(hào)通路是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一。JAKs家族是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，STATs是JAKs激酶的底物，磷酸化的STATs以二聚體的形式存在并轉(zhuǎn)移到核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)。以往對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究［11，12］表明，JAK/STAT 信號(hào)通路在高糖、細(xì)胞因子等多種刺激因素誘導(dǎo)上皮轉(zhuǎn)化中均發(fā)揮重要作用。由此，我們考慮JAK/STAT信號(hào)通路可能也參與了高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，我們首先檢測(cè)了高糖刺激后足細(xì)胞中p-JAK2和p-STAT1的表達(dá)，證實(shí)高糖可以激活足細(xì)胞中的JAK/STAT信號(hào)通路。之后我們?cè)诟咛钦T導(dǎo)足細(xì)胞轉(zhuǎn)化的同時(shí)采用AG490進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單純高糖刺激相比，同時(shí)加入AG490干預(yù)后，在抑制JAK/STAT通路的同時(shí)，足細(xì)胞中α-SMA蛋白及其mRNA表達(dá)明顯降低。提示AG490可通過(guò)阻斷JAK/STAT信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果為DN蛋白尿的防治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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