金黃色葡萄球菌耐藥性及腸毒素分型研究

史 紅，王 娟，鄭增忍＊，單 虎，王述柏，李玉清，黃秀梅，劉開(kāi)成，韓 艷，張 鵬

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

金黃色葡萄球菌耐藥性及腸毒素分型研究

史 紅1，王 娟2，鄭增忍2＊，單 虎1，王述柏1，李玉清2，黃秀梅2，劉開(kāi)成1，韓 艷1，張 鵬1

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

為了解從生鮮乳中分離得到的31株金黃色葡萄球菌的耐藥性和腸毒素分布情況，用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，用PCR方法進(jìn)行腸毒素的檢測(cè)和分型。結(jié)果表明，31株金黃色葡萄球菌耐藥率在50%以上的抗菌藥有7種，藥耐藥率小于10%的有3種；敏感率大于50%的抗菌藥有6種，敏感率小于10%的有5種。31株金黃色葡萄球菌毒素基因攜帶率為93.5%，同時(shí)攜帶2種及以上毒素的菌株占67.7%，有SEA基因的占38.7%，含其他傳統(tǒng)的毒素基因類(lèi)型SEB、SEC、SED和SEE基因的菌株只占40.4%，攜帶新發(fā)現(xiàn)的毒素基因SEG、SHE、SEI和SEJ的菌株占67.7%。說(shuō)明本次試驗(yàn)中的31株金黃色葡萄球菌對(duì)6類(lèi)13種抗菌藥都有不同程度的耐藥性，且多重耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重。生鮮乳中分離的金黃色葡萄球菌帶毒率高，且攜帶新發(fā)現(xiàn)的腸毒素基因較多。

金黃色葡萄球菌；耐藥性；腸毒素

奶牛乳房炎是世界范圍內(nèi)發(fā)生最普遍、防治最難的奶牛疾病之一。奶牛乳房炎不僅引起奶牛產(chǎn)乳量的下降和乳品質(zhì)的改變，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)使奶牛泌乳機(jī)能完全喪失，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，有時(shí)還會(huì)影響食用者的身體健康［1］。病原微生物感染是奶牛乳房炎的主要發(fā)病因素。引起奶牛乳房炎的病原微生物的種類(lèi)繁多，有細(xì)菌、支原體、真菌、病毒等。據(jù)楊克禮等［2］報(bào)道，患乳房炎的奶牛乳汁中以金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的帶菌率最高，其次是大腸埃希菌（Escherichiacoli）和鏈球菌（Streptococcus）。目前使用抗生素是治療奶牛乳房炎的主要方法，但隨著抗生素在世界范圍內(nèi)的大量使用及濫用，導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥性［3］。

金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生多種毒素，主要有腸毒素 （staphylococcal enterotoxins，SEs）、剝脫毒素（exfoliative toxin，ETs）和毒性休克綜合征毒素1（toxic shock syndrome toxin，TSST-1）等。腸毒素是引起食物中毒的主要因子，由金黃色葡萄球菌引起的食品中毒是個(gè)世界性衛(wèi)生問(wèn)題，在美國(guó)由其引起的食品中毒占整個(gè)細(xì)菌性食品中毒的33%，加拿大則更多，達(dá)45%［4］。我國(guó)也常發(fā)生金黃色葡萄球菌食物中毒，是衛(wèi)生防疫部門(mén)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。金黃色葡萄球菌腸毒素是一類(lèi)結(jié)構(gòu)相關(guān)、毒力相似、抗原性不同、對(duì)熱穩(wěn)定（100℃耐熱30min）的外毒素，除了SEA、SEB、SEC、SED、SEE 5種傳統(tǒng)的血清型外，近幾年還發(fā)現(xiàn)了 SEG、SHH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN 和SEO 等新型的腸毒素［5－7］。本文對(duì)從生鮮乳中分離到的31株金黃色葡萄球菌進(jìn)行了耐藥性研究和腸毒素的分型分布的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 在奶牛場(chǎng)采集生鮮乳，從生鮮乳中分離得到31株金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌 ATCC29213購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.1.2 藥品及試劑 動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性金黃色葡萄球菌凍干型細(xì)菌定量藥敏（MIC）測(cè)試盒為天津市金章科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品，配套產(chǎn)品有凍干藥敏試劑盒、0.5麥?zhǔn)媳葷峁堋?.5mL 無(wú)菌4.5g／L NaCl溶液安瓿（制備0.5麥?zhǔn)洗郎y(cè)菌懸液）、10mL MH肉湯管及30mL V型無(wú)菌槽；胰蛋白胨、瓊脂粉和酵母粉為北京陸橋技術(shù)有限公司產(chǎn)品；溶菌酶和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；Taq酶和DNA Marker為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)臨床藥物的使用情況和對(duì)公共衛(wèi)生的影響選擇6類(lèi)13種抗菌藥，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）微量肉湯稀釋法（M38-A2文件）檢測(cè)所有菌株對(duì)這6類(lèi)13種抗菌藥的最低抑菌濃度。6類(lèi)13種抗菌藥分別是青霉素類(lèi)（青霉素／P、氨芐西林／AM、奧格門(mén)?。疉／C），頭孢類(lèi)（頭孢西?。疌X、頭孢噻呋／CEF），大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（替米考星／TIL、紅霉素／E、泰妙菌素／TIA），萬(wàn)古霉素類(lèi)（萬(wàn)古霉素／Va），磺胺類(lèi)（磺胺異惡唑／SF、新諾明／SXT），氟喹諾酮類(lèi)（恩諾沙星／ENR、氧氟沙星／OFL）。

對(duì)保存的31株金黃色葡萄球菌菌株根據(jù)凍干型細(xì)菌定量藥敏（MIC）測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.2.2 金黃色葡萄球菌分離株腸毒素基因分型

1.2.2.1 模板DNA的制備 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)制備模板DNA。

1.2.2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增 對(duì)所有菌株做腸毒素基因 SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI和SEJ的檢測(cè)。

PCR反應(yīng)體系：模板DNA 1μL、上下游引物（20pmol／μL）各0.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2（25mmol／L）2μL，dNTP Mixture（2.5 mmol／L）0.5μL，Taq酶（5u／μL）0.5μL，加滅菌蒸餾水至25μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10min。PCR產(chǎn)物用15g／L瓊脂糖凝膠電泳，電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中成像。引物見(jiàn)表1［8］。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

31株金黃色葡萄球菌分離菌株對(duì)6類(lèi)13種抗菌藥都有不同程度的耐藥性。對(duì)青霉素類(lèi)藥物（氨芐西林、青霉素、奧格門(mén)?。┑哪退幮宰顕?yán)重，對(duì)氨芐西林和青霉素的耐藥率均為100%，對(duì)奧格門(mén)丁的耐藥率為93.55%，其次是對(duì)是紅霉素和頭孢噻呋，耐藥率均為96.77%，對(duì)頭孢西丁的耐藥率為64.52%，對(duì)磺胺異惡唑的耐藥率為54.84%，耐藥率在50%以上抗菌藥有7種。對(duì)氧氟沙星的耐藥率為6.45%，對(duì)恩諾沙星和新諾明的耐藥率均為3.23%，對(duì)泰妙菌素、替米考星、萬(wàn)古霉素均無(wú)耐藥性。31株金黃色葡萄球菌分離菌株除對(duì)青霉素類(lèi)藥物的氨芐西林、青霉素及大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的紅霉素?zé)o敏感性外，對(duì)其余10種抗菌藥都有不同程度的敏感性。其中對(duì)泰妙菌素、替米考星、萬(wàn)古霉素的敏感率均為100%，其次是新諾明、恩諾沙星，敏感率分別為96.77%、93.54%，敏感率大于50%的有6種抗菌藥，敏感率小于10%的有5種藥物（表1）。

表1 引物序列Table 1 Nucleotide seguences of the primers

2.2 分離菌株腸毒素檢測(cè)結(jié)果

對(duì)金黃色葡萄球菌腸毒素基因SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SHH、SEI和SEJ的PCR結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)增，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。由擴(kuò)增結(jié)果可知，金黃色葡萄球菌腸毒素基因SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SHH、SEI和SEJ的擴(kuò)增條帶大小與設(shè)計(jì)相符，說(shuō)明此方法較為有效。

結(jié)果表明從生牛奶中分離的31株金黃色葡萄球菌檢測(cè)到SEA-SAJ基因的有29株，占93.5%，同時(shí)攜帶2種及以上毒素基因的菌株有21株，占67.7%。帶有SEI腸毒素基因的最多，有25株，占80.6%。攜帶傳統(tǒng)腸毒素基因SEA-SEE的總共有13株，占40.4%。攜帶新型腸毒素SEG-SEJ的菌株較多共有29株，占87.1%。攜帶各型腸毒素基因的菌株數(shù)量見(jiàn)圖2。

圖1 各型腸毒素基因擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis results of each type of enterotoxin genes

表2 31株金黃色葡萄球菌分離株藥敏感性檢測(cè)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test of 31 Staphylococcusaureus isolates

圖2 31株金黃色葡萄球菌分離株腸毒素檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The results of enterotoxin detection of the 31 Staphylococcusaureus isolates

3 討論

本次研究中31株金黃色葡萄球菌對(duì)6類(lèi)13種抗菌藥都有不同程度的耐藥性，多重耐藥現(xiàn)象也比較嚴(yán)重。從分離菌株耐藥譜可以看出，31株金黃色葡萄球菌中沒(méi)有0耐菌株出現(xiàn)，無(wú)4耐以下、9耐及10耐以上菌株，4耐、8耐及10耐各有1株菌。分離菌株都具有多重耐藥性，主要集中在5耐～7耐，占總分離菌株的90.32%。菌株耐藥主要是由于動(dòng)物在飼養(yǎng)過(guò)程中使用亞治療量的抗生素。耐藥菌排入環(huán)境后能長(zhǎng)期保持耐藥性，細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)不僅給臨床及獸醫(yī)用藥帶來(lái)了麻煩，重要的是其耐藥性還可通過(guò)食物鏈傳播，臨床細(xì)菌的耐藥性與食物中細(xì)菌的耐藥性直接相關(guān)［9－10］。食源性致病菌的耐藥性對(duì)食品安全及人類(lèi)健康造成了嚴(yán)重的威脅，現(xiàn)已引起很多國(guó)家的重視?？刂偏F藥在飼養(yǎng)過(guò)程中的使用，并嚴(yán)格遵守安全休藥期對(duì)降低食源性耐藥菌株的出現(xiàn)有著重要意義。

對(duì)于金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)，以往主要用免疫學(xué)方法，不僅費(fèi)時(shí)，而且比較困難。原因是：①腸毒素的特異性抗體難以制備；②腸毒素的表達(dá)在不同條件下差異很大，常出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果，毒株含有毒素基因但基因表達(dá)不好或缺乏穩(wěn)定的遺傳成分時(shí)易出現(xiàn)假陰性，有些毒株的血清型容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，因而又常出現(xiàn)假陽(yáng)性［11］。本文用PCR技術(shù)對(duì)腸毒素進(jìn)行了檢測(cè)，PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性、靈敏度高的特點(diǎn)，既節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，又可節(jié)省人力物力，達(dá)到事半功倍的效果。

金黃色葡萄球菌腸毒素類(lèi)型眾多，攜帶各類(lèi)腸毒素基因的金黃色葡萄球菌廣泛存在。不同類(lèi)別的腸毒素基因在金黃色葡萄球菌中的分布狀況的研究日益受到重視。宋黎黎等［12］從正常人咽拭子中分離的54株金黃色葡萄球菌，同時(shí)攜帶2種及以上毒素基因的菌株占44.4%。帶有SED腸毒素基因的菌株最多占44.4%，檢測(cè)到SEA基因占18.5%，SEB、SEC和SEJ基因分別占9.3%，SEE、SEG和SEI基因分別占14.8%，SHE基因占37.0%。張嚴(yán)峻等［13］從感染病人中分離的80株金黃色葡萄球菌毒素基因攜帶率為85.0%，同時(shí)攜帶2種及以上毒素基因的菌株占52.94%，有SEA基因的占29.4%，含其它傳統(tǒng)的毒素基因類(lèi)型SEB、SEC、SED和SEE基因的菌株只占39.71%，攜帶新發(fā)現(xiàn)的毒素基因SEG、SEH、SEI和SEJ的菌株占83.82%。Hazariwala A等［14］從家禽中分離到34株金黃色葡萄球菌，檢測(cè)SEA、SEB、SEC、SED、SEE基因，其中1株為陽(yáng)性。這與我們的結(jié)果有很大差別，表明，腸毒素基因的分布狀況與菌株的來(lái)源存在相關(guān)性。對(duì)不同來(lái)源的菌株的各型腸毒素的分布還有待進(jìn)行系統(tǒng)的和深入的研究。

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Drug Susceptibility Test and Typing of Toxin Genes amongStaphylococcusaureus

SHI Hong1，WANG Juan2，ZHENG Zeng-ren2，SHAN Hu1，WANG Shu-bai1，LI Yu-qing2，HUANG Xiu-mei2，LIU Kai-cheng1，HAN Yan1，ZHANG Peng1

（1.QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao，Shandong，266109，China；2.ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，Qingdao，Shandong，266032，China）

To research on the drug susceptibility and the type of toxin genes ofStaphylococcalaureusisolates from raw milk of cows，drug susceptibility was tested with the broth microdilution method.Toxin genes were amplified by PCR，and detected by electrophoresis.The results showed that there were 7antimicrobials to which the resistant rates of 31Staphylococcusaureusisolates were higher than 50%，and 3 antimicrobials lower than 10%.And there were 6antimicrobials to which the drug-susceptibility rates were higher than 50%，and 5antimicrobials lower than 10%.The toxin genes of SEA-SEE and SEG -SEJ could be detected from 31Staphylococcusaureusisolates from raw milk of cows.Staphylococcusaureusisolates with toxin genes accounted for 93.5%of all theStaphylococcusaureusisolates，the isolates with more than one toxin genes accounted for 67.7%，the isolates with SEA gene accounted for 48.4%，the isolates with other traditional toxin genes accounted for 40.4%，and the isolates with newly found toxin genes accounted for 67.7%.Therefore，31Staphylococcusaureusisolates were resistant to antimicrobials to varying degrees，and multiple-antibiotic-resistant was serious.Staphylococcusaureusisolates with toxin genes accounted for high ratio，and with newly found toxin genes also accounted for high ratio.

Staphylococcusaureus；drug susceptibility；toxin gene

S852.611

A

1007-5038（2012）06-0087-04

2012-02-13

史 紅（1987－），女，山東臨沂人，碩士，主要從事動(dòng)物流行病學(xué)與動(dòng)物產(chǎn)品衛(wèi)生安全研究。＊通訊作者