間接ELISA 在豬瘟抗體檢測上的應(yīng)用

李 嬌，沈志強(qiáng)，＊，祖立闖，王金良，謝金文

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起豬在臨床上主要以稽留高熱、皮膚和黏膜出現(xiàn)大量出血點(diǎn)為主要特征的一種高度接觸性、致死性傳染病［1-2］。豬瘟病毒主要通過呼吸道和消化道傳染，傳播速度快，發(fā)病率和病死率高，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3-6］。豬瘟被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的動物傳染病，被我國列為一類動物疫病，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的動物疫病之一［7］。豬瘟的診斷方法主要包括病毒的分離與鑒定、血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測方法［8］。其中，血清學(xué)檢測方法是豬瘟診斷的重要手段，也是免疫豬群抗體水平監(jiān)測的主要方法，對豬瘟流行狀態(tài)的監(jiān)測、疫苗免疫效果評價(jià)及免疫程序的制定均具有重要意義［9］。豬瘟常規(guī)的血清學(xué)檢測方法主要有病毒中和試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)、ELISA、膠體金免疫層析等，其中間接ELISA具有簡單、快捷、敏感、特異、高通量等優(yōu)點(diǎn)，在豬瘟的抗體檢測上得到了廣泛應(yīng)用。本文就間接ELISA方法在豬瘟抗體檢測上的應(yīng)用做一綜述，以期為豬瘟防控提供參考。

1 間接ELISA的基本原理與特點(diǎn)

1971年Engvall E等［10］首先發(fā)表了應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）進(jìn)行IgG定量測定的論文。隨后，ELISA成為繼免疫熒光技術(shù)和放射性同位素免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種新型的免疫酶技術(shù)。ELISA既可用于測定抗原，也可用于測定抗體，常用的有直接法、間接法、夾心法、競爭法（阻斷法）。間接ELISA是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（酶標(biāo)二抗）檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體（一抗），首先用特異性抗原包被固相載體，加入待測抗體（一抗），使之與固相抗原結(jié)合；再加入酶標(biāo)記的抗抗體（酶標(biāo)二抗），使之與待測抗體結(jié)合；再加入底物顯色液，顯色顏色的深淺與待測抗體的量成正比。

此方法的優(yōu)點(diǎn)有：①檢測面廣，只要更換包被抗原就可利用同一個(gè)酶標(biāo)二抗建立檢測相應(yīng)疫病抗體的方法；②檢測快速，一般只要2h～3h就可以給出結(jié)果；③簡單方便，操作步驟簡單、對操作人員無特殊技能要求；④穩(wěn)定性好，使用同一批純化抗原、酶標(biāo)抗體，具有良好的可重復(fù)性；⑤特異性強(qiáng)，抗原抗體的結(jié)合依賴于抗原決定簇與抗體特定化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型的互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的專一性；⑥靈敏度高，酶的催化可極大的放大反應(yīng)效果，達(dá)到很高的敏感度。此方法的缺點(diǎn)是：①對包被抗原的純度要求高，間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度，純度越高，特異性越強(qiáng)；②待檢血清常含有非特異性IgG，血清總IgG中受檢的特異性IgG只占小部分，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，增加試驗(yàn)的非特異性反應(yīng)。因此，抗原包被后一般用無關(guān)蛋白質(zhì)（如BSA、脫脂奶粉）再包被一次（封閉），以封閉固相載體上的空余間隙。

2 間接ELISA在豬瘟抗體檢測中的應(yīng)用

間接ELISA方法是目前檢測豬瘟抗體的主要方法，利用豬瘟病毒抗原建立間接ELISA方法存在病毒不易培養(yǎng)，不易純化，生產(chǎn)成本過高等不利因素，且具有潛在的散毒危險(xiǎn)，不適合在基層單位及臨床血清調(diào)查中使用。利用基因工程方法表達(dá)病毒保護(hù)性抗原基因已逐步得到重視，基因工程抗原具有安全穩(wěn)定，易于生產(chǎn)純化、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，且重組抗原只能與病毒特定成分所誘生的抗體發(fā)生反應(yīng)，可用于亞單位或標(biāo)記疫苗免疫動物與自然感染動物的鑒別診斷。

CSFV基因組編碼C、Erns（E0）、E1、E2 4種結(jié)構(gòu)蛋白和Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B8種非結(jié)構(gòu)蛋白［11］，CSFV感染后可以產(chǎn)生針對結(jié)構(gòu)蛋白E2和E0以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的抗體，所以理論上檢測這幾種蛋白特異性抗體結(jié)果存在一致性。E2蛋白含有豐富的抗原表位，是CSFV最主要的免疫保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)高效價(jià)的中和抗體，是研制診斷試劑和基因工程標(biāo)記疫苗的主要靶抗原；E0蛋白是病毒吸附進(jìn)入敏感細(xì)胞的必需蛋白，具有中和表位，但只能提供部分免疫保護(hù)；NS3蛋白是一種免疫優(yōu)勢蛋白，含有瘟病毒群共同的抗原表位，導(dǎo)致NS3抗體特異性較低。目前，研制基于E2蛋白的標(biāo)記疫苗是豬瘟新型疫苗研究的熱點(diǎn)，并且已經(jīng)研制多種基于E2蛋白的基因工程標(biāo)記疫苗［12］。應(yīng)用E2蛋白標(biāo)記疫苗后，可以用另外一種病毒蛋白（E0或NS3）來進(jìn)行標(biāo)記疫苗免疫與自然感染野毒產(chǎn)生抗體的血清學(xué)鑒別診斷，從而便于從免疫豬群中淘汰凈化強(qiáng)毒感染豬，減少未感染的免疫豬被誤殺的可能。

2.1 基于E2蛋白的豬瘟抗體間接ELISA檢測方法

囊膜蛋白E2是CSFV中免疫功能最重要的蛋白，攜帶有能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的抗原決定簇，可誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體，是近年來研制新型疫苗和血清學(xué)診斷抗原以及研究CSFV抗原變異的主要對象［13］。通過對E2蛋白的抗原結(jié)構(gòu)分析證實(shí)，E2蛋白包括4個(gè)相對獨(dú)立的抗原結(jié)構(gòu)域（A、B、C、D），誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的表位被定位在抗原結(jié)構(gòu)域A、B和C［14］。

尹雙輝等［15］將豬瘟疫苗毒株E2基因主要抗原區(qū)（A-D）基因克隆到表達(dá)載體pGEX-6p-1，轉(zhuǎn)化E.coli，降低誘導(dǎo)溫度至20℃，獲得48Ku大小的E2融合蛋白，部分目的蛋白以可溶性形式表達(dá)。Western blot試驗(yàn)證實(shí)E2融合蛋白可以和CSFV陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合。以親和層析純化后的E2融合蛋白作為抗原，建立了檢測CSFV血清抗體的間接ELISA方法。該方法與PRRSV、PCV-2、PPV和PRV陽性血清之間不存在交叉反應(yīng)，用該方法和國外同類試劑盒（CSF-Ab-Kit）同時(shí)檢測142份田間血清樣品，2種試劑盒的陽性檢測率分別為83.81%和88.73%。該方法通過降低重組蛋白的誘導(dǎo)溫度，促進(jìn)了E2蛋白以可溶性的形式表達(dá)，避免了包涵體變性和復(fù)性復(fù)雜過程，且利用親和層析純化E2蛋白操作過程簡單，抗原純度好，建立的間接ELISA方法操作簡便、快速、敏感性高、特異性強(qiáng)，可作為豬瘟臨床大規(guī)模血清學(xué)調(diào)查的診斷方法，為間接ELISA檢測試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)，為評價(jià)豬瘟疫苗效果和豬瘟綜合控制提供了技術(shù)手段。謝金文等［16］參照已發(fā)表的CSFV C株基因組序列，應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增了包含A、B、C、D共4個(gè)中和抗原區(qū)在內(nèi)約786bp的E2基因片段，將目的片段定向克隆到pET30a原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得了以包涵體形式表達(dá)的重組E2蛋白，采用鎳離子親和層析純化重組蛋白，經(jīng)免疫印跡檢測證明純化具有良好的抗原性和特異性。以該純化蛋白為包被抗原，初步建立了CSFV間接ELISA檢測方法。李嬌等［17］在此基礎(chǔ)上，以純化的CSFV重組E2蛋白為包被抗原，以辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白（HRP-SPA）為酶標(biāo)二抗，研制了檢測CSFV抗體的PPA-ELISA診斷試劑盒。該試劑盒與其他7種常見豬病病毒（PRRSV、PPV、JEV、PCV-2、PEDV、PRV、TGEV）的陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)；批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于5%，批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于10%；與間接血凝試驗(yàn)相比較，符合率、敏感性和特異性分別為86.2%、85.4%和87.2%；與IDEXX ELISA試劑盒相比較，符合率、敏感性和特異性分別為91.3%、93.2%和88.7%。該E2-PPAELISA抗體檢測試劑盒具有良好的重復(fù)性、敏感性和特異性，為CSF的快速診斷、疫苗免疫豬群抗體監(jiān)測和CSF流行病學(xué)調(diào)查提供一種快速、簡便的血清學(xué)診斷試劑盒，適合基層獸醫(yī)單位廣泛推廣應(yīng)用。

2.2 基于E0蛋白的豬瘟抗體間接ELISA檢測方法

糖蛋白E0是CSFV包膜蛋白與核酸酶，也是病毒吸附進(jìn)入敏感細(xì)胞的必需蛋白，其活性對病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染有直接關(guān)系，為誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的保護(hù)性抗原之一［18］。目前，研究的CSFV基因工程疫苗主要以E2蛋白為抗原，基于CSFV E0蛋白建立相應(yīng)的抗體檢測技術(shù)對監(jiān)測豬瘟的流行情況，區(qū)分E2標(biāo)記疫苗免疫豬和野毒感染豬均具有重要意義。

賈洪林等［19］將大腸埃希菌表達(dá)的CSFV重組E0蛋白經(jīng)純化后作為包被抗原，建立了檢測豬瘟抗體的E0-ELISA方法，確定了最適抗原包被量為0.15μg，血清最適稀釋度為1∶100。該方法檢測PRRSV、PRV、PCV2、PPV、TGEV、PDEV陽性血清均為陰性。對高、中、低效價(jià)的3份豬瘟陽性血清進(jìn)行E0-ELISA檢測后，板內(nèi)變異系數(shù)與板間變異系數(shù)均低于10%。與基于重組E2蛋白的E2-ELISA的符合率高達(dá)96.7%，與基于全病毒抗原的Dot-ELISA符合率為77.5%。該方法簡便、特異、穩(wěn)定，可以用于豬瘟抗體的血清學(xué)監(jiān)測以及用作基于E2蛋白的標(biāo)記疫苗配套的鑒別診斷。李鵬等［20］將CSFV野毒株FJ237-E0基因插入原核表達(dá)載體pET32a中，以BL21（DE3）為表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的E0蛋白分子質(zhì)量約為50.3ku，為可溶性蛋白，表達(dá)量占菌體總蛋白的30%，將表達(dá)的重組蛋白通過His親和層析柱進(jìn)行純化，以純化的E0融合蛋白作為診斷抗原，通過ELISA方陣確定的最佳抗原包被量為100ng，血清稀釋倍數(shù)為1∶30，建立檢測豬瘟E0抗體的ELISA方法與IDEXX公司豬瘟病毒抗體檢測試劑盒的陽性符合率為92.3%，陰性符合率為85.7%。該方法的建立不但為豬瘟抗體監(jiān)測提供了一種比較實(shí)用的血清學(xué)監(jiān)測手段，也為進(jìn)一步開發(fā)診斷豬瘟抗體的檢測試劑盒及研制標(biāo)記疫苗所需的配套診斷試劑奠定基礎(chǔ)。吳素麗等［21］擴(kuò)增克隆E0基因，插入原核表達(dá)載體pET32a，轉(zhuǎn)化進(jìn)BL2l（DE3）內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。將表達(dá)的重組pET-E0蛋白通過His親和層析柱純化，以純化后的蛋白為診斷抗原，包被96孔聚乙烯平板，建立檢測豬瘟E0抗體的ELISA方法。分別使用IDEXX豬瘟抗體ELISA試劑盒檢測和該ELISA方法檢測200份臨床血清樣品，IDEXX試劑盒檢出陽性血清186份，E0-ELISA檢出陽性血清154份，兩者符合率為83%。E0-ELISA在標(biāo)記疫苗的研制和應(yīng)用上具有重要的血清學(xué)鑒別功能，對于監(jiān)測豬瘟病毒的流行情況和疫苗免疫情況及制定免疫程序具有重要作用。

2.3 基于NS3蛋白的豬瘟抗體間接ELISA檢測方法

CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3蛋白是該病毒最保守的蛋白之一，是瘟病毒引起細(xì)胞病變作用主要因子，是病毒復(fù)制增殖必需蛋白，在動物體體內(nèi)能產(chǎn)生不同程度的抗體［22-23］。以NS3蛋白為抗原建立間接ELISA可以作為CSF的血清學(xué)鑒別診斷方法。

蔣大良等［24］將NS3基因克隆至原核表達(dá)載體pET-32a，構(gòu)建成重組原核表達(dá)載體pET-NS3，在大腸埃希菌Rosetta（DE3）中進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)，SDSPAGE分析重組蛋白NS3以包涵體形式表達(dá)，Western blot分析表明重組蛋白NS3具有良好的免疫原性，采用Ni＋親和層析方法純化重組蛋白，以純化的重組蛋白NS3為抗原建立了檢測CSFV NS3抗體的間接ELISA方法，應(yīng)用該方法和IDEXX公司CSFV-Ab檢測試劑盒同時(shí)檢測221份不同豬群和年齡豬的血清樣品，二者陽性符合率為83.33%，陰性符合率為89.38%，總符合率為86.43%。對30份存在差異的血清樣品用間接免疫熒光法（IFA）進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示IFA檢測結(jié)果與NS3-ELISA和IDEXX CSFV-Ab檢測試劑盒符合率分別為56.67%和43.33%。該檢測方法與IDEXX公司CSFV-Ab檢測試劑盒和IFA檢測結(jié)果存在較高的一致性，具有較好的可重復(fù)性，可以作為CSF血清學(xué)診斷方法。

3 結(jié)語

我國現(xiàn)階段豬瘟流行形勢復(fù)雜，沒有明顯規(guī)律性，豬瘟仍是我國動物疫病防控的一大難題，防控任務(wù)艱巨。CSFV特異性抗體的檢測對于評價(jià)弱毒疫苗免疫效果和控制豬瘟有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。間接ELISA以其靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定、高通量及易于操作等優(yōu)點(diǎn)，為CSFV的診斷提供了新的模式。目前，國內(nèi)學(xué)者已經(jīng)建立了多種豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測方法，并得到了良好的應(yīng)用效果。相信隨著基因體外表達(dá)技術(shù)的不斷深入與發(fā)展，間接ELISA操作技術(shù)的日趨成熟和完善，間接ELISA試劑盒的不斷研制與組裝，間接ELISA在豬瘟的檢測上將會有更加廣闊的應(yīng)用前景，將為豬瘟的預(yù)防和控制提供合理的科學(xué)依據(jù)。

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