一種新的角膜緣干細(xì)胞分選方法△

張 偉 楊為中 金 敏 高宗銀 陳曉燕 許艷麗 張玉平

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，組織工程技術(shù)正在成為治療組織、器官衰竭的有效方法和輔助手段。這標(biāo)志著醫(yī)學(xué)將走出器官移植的范疇，步入制造組織和器官的新時(shí)代，即再生醫(yī)學(xué)的新時(shí)代。將種子細(xì)胞種植在支架上是構(gòu)建組織工程產(chǎn)品的基本方法［1］。因此種子細(xì)胞在組織工程角膜中占據(jù)非常重要的地位。

我們以前報(bào)道了采用平板離心的方法［2］，以人角膜緣細(xì)胞系SDHCEC1為種子細(xì)胞構(gòu)建了組織工程角膜上皮片。同時(shí)我們?cè)O(shè)計(jì)了一種利用平板離心方法短時(shí)間內(nèi)形成純細(xì)胞片的方法。實(shí)驗(yàn)中先用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選出最佳離心參數(shù)，然后用多層疊加的方法快速構(gòu)建出細(xì)胞片，對(duì)獲得的純細(xì)胞片中種子細(xì)胞的活性分析顯示細(xì)胞活性明顯高于傳統(tǒng)方法。對(duì)于人角膜緣細(xì)胞系SDHCEC1，在離心轉(zhuǎn)速為1800 r·min－1時(shí)有80%左右的細(xì)胞能夠貼壁黏附，但當(dāng)我們將這種方法應(yīng)用于人角膜上皮組織塊原代培養(yǎng)出的細(xì)胞時(shí)卻發(fā)生了相反的變化，在同樣的離心力下僅20%左右的細(xì)胞貼壁。為什么會(huì)產(chǎn)生這種現(xiàn)象呢?人角膜上皮組織塊原代培養(yǎng)出的細(xì)胞中貼壁的細(xì)胞和不能貼壁的細(xì)胞有什么區(qū)別呢?本次我們通過(guò)細(xì)化平板離心轉(zhuǎn)速分離出三群細(xì)胞，并對(duì)其特征性細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)和增殖活性等進(jìn)行了詳細(xì)研究。

1 材料與方法

1.1 角膜緣上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基的配制 用DMEM無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco BRL)，添加胎牛血清(Gibco BRL)、hEGF重組人胰島素(Gibco BRL)，人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma)、L-Glutamine(Gibco BRL)、青鏈霉素溶液(Gibco BRL)、氫化可的松(Sigma)和非必需氨基酸(Gibco BRL)，混勻后 0.2 μm 濾膜過(guò)濾，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取角膜移植術(shù)后剩余的眼球，用生理鹽水沖洗3次后無(wú)菌條件下鈍性分離角膜板層。用角膜剪將角膜緣剪成2 mm×2 mm大小的組織塊，將組織塊上皮面朝下貼附于25 mm2塑料培養(yǎng)瓶中。將接種有組織塊的培養(yǎng)瓶放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置干燥30 min左右，待組織塊貼附后，加入適量培養(yǎng)液，使其剛剛覆蓋組織塊，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h以上，根據(jù)培養(yǎng)液的顏色變化及時(shí)換液，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。待人角膜緣上皮細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)即可以 2.5 g·L－1胰蛋白酶加 0.1 g·L－1EDTA混合消化液消化收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液吸入離心管中，1000 r·min－1離心 5 min。棄去上清液，用上皮細(xì)胞培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，以備下一步平板離心法分離細(xì)胞使用。

1.3 平板離心法分選角膜上皮細(xì)胞 將原代組織塊培養(yǎng)的細(xì)胞收集后制作細(xì)胞懸液接種于六孔板中，細(xì)胞密度為900×103·cm－2(n=6)，放置于平板離心機(jī)(Eppendorf 5810R，直徑20 cm)中進(jìn)行離心。首先用1400 r·min－1離心4 min，離心結(jié)束后吸取上清液，分別收集上清液和離心貼壁的細(xì)胞(ATC1)，然后將上清液再次用1800 r·min－1離心4 min，分別收集離心貼壁的細(xì)胞(ATC2)和上清液中的細(xì)胞(NAC)。

1.4 分選細(xì)胞免疫組織化學(xué)分析 將上述分選所得三群細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。室溫下，將三群細(xì)胞分別用酒精固定10 min;Triton X-100孵育10 min;山羊血清封閉20 min;加入一抗，4℃過(guò)夜后去除一抗，PBS沖洗，使用一抗為:鼠抗 K3 mAb(Chemicon)、p63 mAb(Chemicon)和 ABCG2 mAb(Santa Cruz，CA);加入羊抗小鼠IgG二抗，室溫下避光孵育2 h，去除二抗PBS沖洗;加入Hoechst33342染核10 min，PBS沖洗;抗熒光衰減封片劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。陰性對(duì)照除一抗用PBS液代替外，其余操作相同。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將上述分選所得三群細(xì)胞分別按以往報(bào)道的方法［3］進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)。即按每皿接種500個(gè)細(xì)胞種植到60 mm×60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，隔日半量換液。進(jìn)行為期1周的培養(yǎng)后，吸出培養(yǎng)液，用PBS輕輕漂洗，然后加入固定液 (甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定20 min。PBS沖洗，用 Giemsa染液(1∶10稀釋)染色10 min，自來(lái)水沖洗后，在光鏡下觀察細(xì)胞克隆的形態(tài)，計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)(＞4個(gè)細(xì)胞為一個(gè)克隆)和細(xì)胞克隆形成率(細(xì)胞克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù) ×100%)。

1.6 流式細(xì)胞儀分析Ki67陽(yáng)性情況 將上述分選所得三群細(xì)胞分別按以往報(bào)道的方法［4-5］進(jìn)流式細(xì)胞儀分析Ki67的陽(yáng)性情況。即分別收集各組細(xì)胞、計(jì)數(shù)、離心;PBS洗1次，離心5 min，棄去上清;固定液固定15 min;加入PBS洗滌1次，離心棄去上清;加入破膜液破膜15 min;加入PBS洗滌1次，離心棄去上清;加入一抗(用PBS或破膜液稀釋)，37℃孵育30 min;PBS洗1次，離心5 min，棄去上清;加入熒光二抗，培養(yǎng)箱內(nèi)37℃放置20 min;PBS洗1次，離心5 min，棄去上清;PBS液定容至500 μL，置入1 mL EP管中上機(jī)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本次數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀Ki67陽(yáng)性檢測(cè)率采用ANOVA進(jìn)行分析，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 平板離心分選所得細(xì)胞的貼壁率和生長(zhǎng)特征

在離心速度為1400 r·min－1時(shí)，細(xì)胞的貼壁率為(11.32 ±2.46)%;在離心速度為 1800 r·min－1時(shí)，細(xì)胞的貼壁率為(18.55±2.79)%，上清液中懸浮而不能貼壁的細(xì)胞則為(68.29±4.07)%。倒置顯微鏡下觀察ATC1細(xì)胞生長(zhǎng)緊密，形態(tài)較小且均一;ATC2的細(xì)胞形態(tài)變大，細(xì)胞形態(tài)不均一;而NAC則表現(xiàn)出明顯老化的現(xiàn)象，細(xì)胞出現(xiàn)空泡，有些細(xì)胞死亡漂浮于培養(yǎng)液中。

2.2 p63、ABCG2和K3表達(dá)情況 共聚焦顯微鏡觀察顯示(圖1)，ATC1 p63和ABCG2陽(yáng)性表達(dá)率最高，而K3幾乎沒(méi)有表達(dá);ATC2僅有小部分表達(dá)p63和ABCG2，大部分表達(dá)K3;而 NAC不表達(dá) p63和ABCG2，但K3幾乎完全表達(dá)。

2.3 細(xì)胞增殖活性

2.3.1 細(xì)胞克隆能力 細(xì)胞克隆形成率檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示ATC1細(xì)胞克隆形成最多，克隆形成率為(3.90±0.17)%，而ATC2和NAC細(xì)胞克隆形成率則分別為(2.48 ±0.19)% 和(0.84 ±0.89)%(n=6，P=0.000)。觀察克隆的形態(tài)可見(jiàn):ATC1形成的克隆較其他細(xì)胞形成的克隆稍大一些。

2.3.2 細(xì)胞Ki67陽(yáng)性率 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞Ki67陽(yáng)性率結(jié)果(圖3)顯示ATC1 Ki67陽(yáng)性率最高，為(56.78±2.39)%，而 ATC2 和 NAC 細(xì)胞 Ki67陽(yáng)性檢測(cè)率則分別為(9.67±1.88)%和(4.76±0.57)%(n=6，P=0.000)。

Figure 1 Expression of ABCG2，p63 and K3 in ATC1，ATC2 and NAC ABCG2、p63 和 K3在 ATC1、ATC2和 NAC 中的表達(dá)情況

Figure 2 Cell clone of ATC1，ATC2 and NAC ATC1、ATC2和NAC細(xì)胞克隆形成情況

Figure 3 Positive expression of Ki67 in ATC1，ATC2 and NAC ATC1、ATC2和NAC的Ki67陽(yáng)性檢測(cè)情況

3 討論

角膜緣干細(xì)胞是角膜上皮更新的細(xì)胞源泉，由于眼燒傷、化學(xué)傷等各種原因所致的角膜緣干細(xì)胞缺損可引起持續(xù)性角膜上皮缺損，嚴(yán)重者甚至發(fā)生基質(zhì)溶解、角膜穿孔，是臨床上十分棘手的問(wèn)題。來(lái)自于供體角膜的同種異體或自體角膜緣干細(xì)胞移植治療角膜緣干細(xì)胞缺損已取得了較好的臨床效果，但供體材料來(lái)源有限等困難嚴(yán)重制約了這一治療方法的廣泛開(kāi)展，組織工程角膜則應(yīng)此局限孕育而生，蓬勃發(fā)展。

角膜上皮組織的代謝是依靠角膜緣組織中存在的干細(xì)胞來(lái)維持的，分離純化角膜緣干細(xì)胞對(duì)于組織工程角膜的構(gòu)建和研究角膜干細(xì)胞的特性非常重要。目前有報(bào)道可根據(jù)其 SP phenotype［6］、細(xì)胞大?。?］、慢周期細(xì)胞［8］、克隆形態(tài)［9］和體外黏附［10］等特性來(lái)進(jìn)行分離純化。角膜緣干細(xì)胞是一群形態(tài)較小，核質(zhì)比較大的慢周期細(xì)胞，目前缺乏特異性識(shí)別物，只能通過(guò)間接識(shí)別的方法，如其陽(yáng)性表達(dá)ABCG2、p63，陰性表達(dá)K3/K12。干細(xì)胞在角膜受傷或體外培養(yǎng)的情況下表現(xiàn)出自我增殖和功能組織再生的潛能。本次我們?cè)陔x心轉(zhuǎn)速為1400 r·min-1時(shí)用平板離心法篩選出的貼壁細(xì)胞ATC1具備上述的角膜緣干細(xì)胞的特性。它們大部分陽(yáng)性表達(dá)角膜緣干細(xì)胞的特異性標(biāo)記ABCG2和p63，而不表達(dá)角膜上皮的分化標(biāo)記物K3，且擁有很強(qiáng)的細(xì)胞克隆能力和很高的增殖能力，即Ki67高表達(dá)。而從細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)看，ATC2類似角膜短暫擴(kuò)充細(xì)胞，NAC類似角膜終末分化細(xì)胞。這表明用平板離心法可篩選出人角膜緣干細(xì)胞。

Krulova等［11］用 Percoll gradient離心法從鼠的角膜緣細(xì)胞分離出了兩種不同的細(xì)胞群，它們發(fā)現(xiàn)高密度部分(占細(xì)胞總量的7%)細(xì)胞體積較小，K12表達(dá)陰性而p63表達(dá)陽(yáng)性。他們沒(méi)有像我們細(xì)化分離且使用的分離方式復(fù)雜，易將細(xì)胞中參入其他物質(zhì)。

在組織工程和細(xì)胞特性的研究中，細(xì)胞的新鮮和純化非常重要。目前的一些方法是根據(jù)干細(xì)胞的一些特征性的標(biāo)記物用流式細(xì)胞分選出角膜緣干細(xì)胞，這種方法需要很多處理步驟。也有學(xué)者用細(xì)胞克隆分析的方法來(lái)分離干細(xì)胞，但這也需要很長(zhǎng)的時(shí)間。Li等［10］利用角膜緣干細(xì)胞細(xì)胞黏附的特性，將培養(yǎng)皿用Ⅳ型膠原包被后篩選干細(xì)胞。但平板離心法尤其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)是，不需包被培養(yǎng)皿，不需特殊的儀器，只需平板離心機(jī)這種常見(jiàn)的儀器即可在4 min內(nèi)快速的分離出干細(xì)胞來(lái)，可以避免細(xì)胞污染，保持細(xì)胞新鮮，對(duì)下一步的研究非常重要。因此，平板離心法可予未包被的培養(yǎng)皿上快速分選出人角膜緣干細(xì)胞，這是一種新的角膜緣干細(xì)胞的分選方法。這些方面并不僅僅局限于分離人角膜緣干細(xì)胞，也許可以應(yīng)用于其他的細(xì)胞領(lǐng)域，我們目前正在進(jìn)行這方面的研究。

1 Dravida S，Gaddipati S，Griffith M，Merrett K，Lakshmi Madhira S，Sangwan VS，et al.A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells:a promising alternative for clinical transplantation［J］.J Tissue Eng Regen Med，2008，2(5):263-271.

2 Zhang W，Xiao J，Li C，Wan P，Liu Y，Wu Z，et al.Rapidly constructed scaffold-free cornea epithelial sheets for ocular surface reconstruction［J］.Tissue Eng Part cmethods，2011，17(5):569-577.

3 Liu J，Song G，Wang Z，Huang B，Gao Q，Liu B，et al.Establishment of a corneal epithelial cell line spontaneously derived from human limbal cells［J］.Exp Eye Res，2007，84(3):599-609.

4 Kawakita T，Higa K，Shimmura S，Tomita M，Tsubota K，Shimazaki J.Fate of corneal epithelial cells separated fromLimbus in vivo［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(11):8132-8137.

5 Sebastian A，Syed F，Perry D，Balamurugan V，Colthurst J，Chaudhry IH，et al.Acceleration of cutaneous healing by electrical stimulation:Degenerate electrical waveform down-regulates inflammation，up-regulates angiogenesis and advances remodeling in temporal punch biopsies in a human volunteer study［J］.Wound Repair Regen，2011，19(6):693-708.

6 Selver OB，Barash A，Ahmed M，Wolosin JM.ABCG2-dependent dye exclusion activity and clonal potential in epithelial cells continuously growing for 1 month fromLimbal explants［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(7):4330-4337

7 Shortt AJ，Secker GA，Munro PM，Khaw PT，Tuft SJ，Daniels JT.Characterization of the limbal epithelial stem cell niche:novel imaging techniques permit in vivo observation and targeted biopsy of limbal epithelial stem cells［J］.Stem Cells，2007，25(6):1402-1409.

8 Pajoohesh-Ganji A，Pal-Ghosh S，Simmens SJ，Stepp MA.Integrins in slow-cycling corneal epithelial cells at the limbus in the mouse［J］.Stem Cells，2006，24(4):1075-1086.

9 Wang H，Tao T，Tang J，Mao YH，Li W，Peng J，et al.Importin 13 serves as a potential marker for corneal epithelial progenitor cells［J］.Stem Cells，2009，27(10):2516-2526.

10 Li DQ，Chen Z，Song XJ，de Paiva CS，Kim HS，Pflugfelder SC.Partial enrichment of a population of human limbal epithelial cells with putative stem cell properties based on collagen type IV adhesiveness［J］.Exp Eye Res，2005，80(4):581-590.

11 Krulova M，Pokorna K，Lencova A，F(xiàn)ric J，Zajicova A，F(xiàn)ilipecm，et al.A rapid separation of two distinct populations of mouse corneal epithelial cells with limbal stem cell characteristics by centrifugation on percoll gradient［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49(9):3903-3908.