視網(wǎng)膜色素變性治療最新進展△

陳 娟 馬曉曄

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一種眼科常見的遺傳性疾病?；颊咴缙诒憩F(xiàn)為“夜盲”，進而表現(xiàn)為周邊視野缺損，最終導(dǎo)致中心視力喪失。該病目前尚無有效的預(yù)防和治愈方法。近年來，隨著基因治療、視網(wǎng)膜移植等技術(shù)在動物實驗中的廣泛開展，給人類RP的治療帶來了新的希望。本文就當前RP的各種最新治療進展綜述如下。

1 基因治療

1.1 RP基因 RP具有多種遺傳方式，其中常染色體顯性遺傳RP(autosomal dominant retinitis pigmentosa，ADRP)占15% ～20%，常染色體隱性遺傳RP(autosomal recessive retinitis pigmentosa，ARRP)占20% ～25%，X染色體連鎖遺傳 RP(X-linked retinitis pigmentosa，XLRP)占10% ～15%，散發(fā)型 RP占40% ～45%［1］。目前已有超過60種ADRP基因、20種ARRP基因及5種XLRP基因被定位;其中引起ADRP的視紫紅質(zhì)基因的突變位點超過150個［2］。與隱性RP相關(guān)的位點有20個，其中14個基因被克隆，多數(shù)基因較為少見。XLRP患者無論從發(fā)病時間還是預(yù)后角度講均最為嚴重，已知有5個位點與XLRP有關(guān)，其中有2個基因已被克隆，這2個基因的蛋白產(chǎn)物在多種組織中表達，但蛋白質(zhì)的確切功能還不清楚。不斷發(fā)現(xiàn)的與RP相關(guān)的基因和位點以及基因突變位點的差異表明，導(dǎo)致RP的分子發(fā)病機制非常復(fù)雜?；虻膹V泛深入研究為基因治療提供了堅實的基礎(chǔ)。

1.2 基因治療途徑 主要分體內(nèi)和體外兩種。體內(nèi)基因治療主要用合適的載體攜帶目的基因經(jīng)視網(wǎng)膜下腔注射或玻璃體腔注射進行治療。所用的載體主要分為病毒載體和非病毒載體。體外基因治療主要是把轉(zhuǎn)基因靶細胞移植到眼內(nèi)，使外源性基因表達與視網(wǎng)膜移植手術(shù)聯(lián)合使用以達到基因治療的目的。

1.3 基因增補 ARRP主要是由于基因突變、基因產(chǎn)物缺乏引起的。對于這種類型的RP，可以通過基因增補技術(shù)把正?；?qū)敫泄饧毎麅?nèi)，以產(chǎn)生正常的基因表型，達到治療的目的。RPE65基因特別表達于視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)，并且在11-順-視黃醛、視桿細胞和視錐細胞視蛋白色基的再循環(huán)中起著重要作用。Mao等［3］將野生型人RHO基因?qū)隦HO-/-小鼠后，視網(wǎng)膜電圖表明接受基因治療的小鼠在治療后6個月，A波振幅增加了79%，治療眼外核層厚度與對照眼相比增加了80%。這些結(jié)果表明，野生型RHO基因具有抑制突變蛋白的功能。Acland等［4］將RPE65基因?qū)?月齡的RPE65-/-狗，95 d后b波的閾值下降4個對數(shù)單位，接近于正常;振幅為正常的16%左右，感光細胞的振幅也為正常的16%，但對照組基本消失。Bemelmans等［5］將慢病毒介導(dǎo)的RPE65基因注射到RPE65-/-小鼠視網(wǎng)膜下腔內(nèi)，可以使RPE65基因在RPE持續(xù)表達，視網(wǎng)膜電圖記錄到的圖像與正常類似。RPE65基因轉(zhuǎn)移后至少4個月內(nèi)可以防止視錐細胞的退化，而對照組小鼠的視錐細胞則完全退化。Sarra等［6］發(fā)現(xiàn)將正常RHO基因?qū)胍暰W(wǎng)膜退化突變小鼠感光細胞后，可使感光細胞的酶活性和細胞功能恢復(fù)正常，且病毒滴度的增加可以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和感光細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)起始速度。

1.4 基因沉默 目前研究認為，ADRP的發(fā)病機制是由于感光細胞中出現(xiàn)異?；虍a(chǎn)物堆積，最后導(dǎo)致細胞壞死。正?；虻膶?dǎo)入并不能達到根本的治療目的，可行的方法是通過基因沉默使突變基因不表達或者少表達蛋白產(chǎn)物。

1.4.1 錘頭狀核酶 錘頭狀核酶是一種小型催化性RNA，具有催化裂解其他順式或反式RNA的功能，可識別特異性片段并產(chǎn)生裂解以催化清除異?；?。目前錘頭狀核酶已應(yīng)用于獲得性免疫缺陷綜合征、帕金森病、血友病及RP等基因治療。Sullivan等［7］的體外研究證實錘頭狀核酶可以有效治療ADRP。Fritz等［8］設(shè)計了一套針對人類P23H視桿蛋白基因的錘頭狀核酶。A1i等［9］認為錘頭狀核酶通過體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，能使RPE細胞復(fù)雜的超微結(jié)構(gòu)缺陷在形態(tài)和功能上得到矯正。Gorbatyuk等［10］使用設(shè)計的錘頭狀核酶Rz397體外轉(zhuǎn)染HEK293細胞與野生型RHO基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后1 d導(dǎo)致RHO mRNA表達下降60%;將AAV2-Rz397從視網(wǎng)膜下腔注入P6小鼠后發(fā)現(xiàn)，錘頭狀核酶可以顯著降低(≥50%)RHO基因在P6小鼠視網(wǎng)膜中的表達。Shaw等［11］將錘頭狀核酶導(dǎo)入P347L豬眼后證實錘頭狀核酶能靶向破壞P347L序列，從而發(fā)揮保護感光細胞的作用。

1.4.2 RNA 干擾 RNA 干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象廣泛存在于動植物的細胞中，是機體為適應(yīng)環(huán)境變化而在蛋白翻譯水平進行調(diào)控的重要機制。與目的基因序列同源的雙鏈小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)進入細胞后導(dǎo)致的基因轉(zhuǎn)錄后沉默現(xiàn)象稱為RNAi。RNAi近幾年來成為眼科治療ADRP的新研究方向。Georgiadis等［12］使用重組腺病毒轉(zhuǎn)錄的針對外周蛋白-2(Prph2)基因的siRNA研究小鼠視網(wǎng)膜上Prph2基因表達情況，發(fā)現(xiàn)短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的siRNA可以有效且特異地使Prph2基因沉默，在小鼠活體經(jīng)視網(wǎng)膜下腔注射后3周開始抑制Prph2基因的表達。Chadderton等［13］最近利用RNAi技術(shù)在ADRP小鼠模型視網(wǎng)膜下腔注射攜帶針對突變RHO siRNA的重組腺病毒載體，同時聯(lián)合移植鼠源性野生型RHO基因，利用視網(wǎng)膜電圖評估療效，結(jié)果表明突變點RNAi聯(lián)合RHO基因移植可以有效治療RHO基因突變引起的ADRP。O’Reilly等［14］同樣利用RNAi技術(shù)聯(lián)合野生型RHO基因轉(zhuǎn)入小鼠活體實驗和細胞實驗均證實針對突變RHO基因的siRNA能抑制90%突變型RHO基因的表達，同時導(dǎo)入的野生型RHO基因能夠正常表達。

1.5 凋亡抑制 Bcl-2家族是研究及應(yīng)用最廣泛的一種抑制凋亡的基因，Bcl-2的表達具有保護光感受器細胞的作用，然而其過度表達也可導(dǎo)致大鼠光感受器細胞死亡，其原因尚不清楚，可能是Bcl-2基因的過度表達破壞了Bcl-2/Bax的平衡。Bcl-2也能抑制γ-PDE基因突變引起感光細胞的凋亡［15］。Yoshizawa等［16］研究發(fā)現(xiàn)，由甲基亞硝基脲誘導(dǎo)的小鼠RP是可以高度再生的，機制主要與Bcl-2蛋白減少、Bax蛋白增加等有關(guān)。Murakami等［17］證實細胞凋亡誘導(dǎo)因子途徑在神經(jīng)保護作用中有著重要的地位，該研究表明細胞凋亡誘導(dǎo)因子可以上調(diào)Bcl-2表達，最終導(dǎo)致感光細胞的凋亡。

2 干細胞移植

誘導(dǎo)多能干細胞是一項創(chuàng)新技術(shù)，可以作為一個無限細胞分化或組織工程來源。最近研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)多能干細胞具有治療 RP等疾病的潛力［18］。Smith等［19］將自體同源骨髓衍生的家族陰性的造血干細胞注入大鼠的退行性靜脈中，可以在一定程度上防治視錐細胞的死亡，保護中心椎體視覺且沒有明顯的排異反應(yīng)。Idelson等［20］利用特定的培養(yǎng)方法，使具有多能分化潛力的人類胚胎干細胞成功培養(yǎng)分化出功能形態(tài)學(xué)上都正常的RPE細胞。為將來治療因RPE細胞異常機能障礙引起的RP提供依據(jù)。Wang等［21］在一項非侵襲性干細胞治療的研究中發(fā)現(xiàn)，在RP大鼠模型的感光細胞還沒有大量喪失之前，在大鼠尾靜脈注射干細胞進行治療，當未治療的大鼠感光細胞只有1～2層時，經(jīng)過干細胞注射治療，大鼠感光細胞增加至5～6層。

3 視網(wǎng)膜移植

RP是由于感光細胞凋亡，最終導(dǎo)致感光細胞功能的喪失［22］。因此RPE移植研究思路即是將RPE細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，注入視網(wǎng)膜下腔或?qū)⒑琑PE細胞和感光細胞片的視網(wǎng)膜用手術(shù)的方法直接植入受體視網(wǎng)膜下腔，用來補充或修復(fù)凋亡的RPE細胞和感光細胞，以達到治療目的。視網(wǎng)膜移植的方法主要分為細胞移植和組織場面移植。

3.1 細胞移植 可進行移植的細胞包括感光細胞、RPE細胞、神經(jīng)干細胞和雪旺細胞等。通常所說的視網(wǎng)膜細胞移植是指感光細胞和RPE細胞移植。Gouras等［23］將正常小鼠中分離的RPE細胞移植到RPE65-/-變性小鼠的視網(wǎng)膜下腔，對照組注射生理鹽水。結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后RPE65-/-小鼠外核層厚度較對照組明顯增厚，同時3.7周后小鼠視網(wǎng)膜電圖顯示振幅明顯增大，提示RPE移植是治療RP的有效方法之一。Sauve等［24］在RP大鼠的視網(wǎng)膜下腔注射人類衍生RPE細胞株ARPE-19，可以部分保留視桿細胞和視錐細胞的視網(wǎng)膜電圖功能。Gouras等［25］首先報道酶解Bruch膜RPE移植術(shù)，他們將人RPE細胞經(jīng)處理后直接注射于猴的Bruch膜，術(shù)后2 h內(nèi)，移植的RPE細胞可與宿主Bruch膜黏合，形成一層類上皮樣細胞層，病理檢查發(fā)現(xiàn)被移植的RPE細胞形態(tài)及功能均正常，說明這一方法的可行性。

3.2 視網(wǎng)膜組織塊移植 Yang等［26］將正常的大鼠光感受器及視網(wǎng)膜移植到3個月大的P23H大鼠(Pro-23-His視紫紅質(zhì)大鼠)，6個月后評估視功能和視錐細胞計數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)移植后的視錐細胞損傷減少了10%，同時視網(wǎng)膜電圖發(fā)現(xiàn)b波振幅增加了78%。Woch等［27］將新生鼠的視網(wǎng)膜片植入37～69 d RP大鼠的視網(wǎng)膜下腔，移植63 d～10個月后，大鼠上丘腦刺激實驗證實植入的視網(wǎng)膜片具有應(yīng)答反應(yīng)。Arai等［28］將完整的視網(wǎng)膜片移植入RP大鼠視網(wǎng)膜后，可以記錄到上丘對閃光的視反應(yīng)。

4 神經(jīng)營養(yǎng)因子

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類對神經(jīng)系統(tǒng)分化、發(fā)育、神經(jīng)元存活、軸突再生有著重要作用的細胞因子。相關(guān)研究已經(jīng)證實眼組織中存在著神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、堿性成纖維細胞生長因子、晶狀體上皮源性生長因子、肝細胞源性生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等，且許多已應(yīng)用于治療各種神經(jīng)退行性疾?。?9］。研究表明各種神經(jīng)營養(yǎng)因子通過玻璃體腔及視網(wǎng)膜下腔注射可以有效挽救RP動物模型的感光細胞，神經(jīng)營養(yǎng)因子多與基因治療相結(jié)合。CNTF已經(jīng)被證實具有視網(wǎng)膜保護作用，且不會引起視網(wǎng)膜下膠質(zhì)細胞增生［30］。Rhee等［31］將 rAAV 介導(dǎo)的 CNTF 注射到 RP小鼠視網(wǎng)膜下腔，發(fā)現(xiàn)可以維持感光內(nèi)視紫紅質(zhì)的表達。Azadi等［32］將CNTF聯(lián)合BDNF移植治療RP小鼠，發(fā)現(xiàn)治療后小鼠TUNEL染色陽性的光感受器細胞數(shù)量較對照組明顯下降，同時體內(nèi)可以檢測到內(nèi)源性CNTF表達顯著增高，證明CNTF聯(lián)合BDNF治療有確定的神經(jīng)保護作用。Zhang等［33］將BDNF質(zhì)粒注入RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔或者玻璃體腔后再行電穿孔術(shù)治療RP，發(fā)現(xiàn)治療組和對照組視網(wǎng)膜光感受器細胞凋亡率有明顯的差異，證明BDNF移植是治療RP的有效方法之一。

5 人工視力

人工視力主要包括視盤植入微電極、視網(wǎng)膜下腔植入人工視網(wǎng)膜硅芯片以及電針療法。Sakaguchi等［34］研究表明，將3個微電極植入已經(jīng)失明的RP患者的左眼視盤，6個月后，通過電刺激患者可以出現(xiàn)視覺反應(yīng)。通過刺激不同的電極患者產(chǎn)生視覺的部位及能感知的形狀也有所不同。在隨后的隨訪中沒有發(fā)現(xiàn)任何并發(fā)癥，提示通過植入電極可以有效地修復(fù)視覺缺損。Chow等［35］研究表明，將人工視網(wǎng)膜硅芯片植入6位患者的右眼，在隨后的6～18個月隨訪中，芯片依靠自帶的電量發(fā)揮一定的功能，沒有移植排異等反應(yīng)，所有患者的視覺都得到一定的改善。

6 其他

Tam等［36］研究表明RHO基因突變引起的RP存在光依賴性。它們在RHO突變基因的小鼠動物模型中進行綠光照射刺激，發(fā)現(xiàn)可以誘發(fā)其感光細胞的變性，因此臨床上應(yīng)給予配戴墨鏡等處理以減少光源對眼視網(wǎng)膜的損傷。另外，還可以通過我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的針灸、中藥等聯(lián)合治療改善視網(wǎng)膜微循環(huán)，進而緩解感光細胞的凋亡。

7 總結(jié)

基因治療將成為RP治療的主要方法，RP基因治療已經(jīng)通過了最初的實驗階段，但在基因治療過程中，其有效性、給藥途徑、載體的安全性等問題還有待于廣大眼科工作者進行深入地研究。希望這些新技術(shù)、新療法能盡早實現(xiàn)治療RP的目標，相信在不久的將來，這些新療法能夠安全有效地治療RP，為RP患者帶來福音。

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