MicroRNA及其在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的研究進(jìn)展△

張 俊 周琦 呂紅彬

目前，糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心腦血管疾病之后影響全球性公共健康的第三大慢性非傳染性疾病。在發(fā)達(dá)國(guó)家，糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是成年人致盲的首位原因。MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA分子，其通過與靶基因序列特異性相互作用，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)。miRNA在線蟲、果蠅、哺乳動(dòng)物、植物，甚至病毒中廣泛存在，其基因以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中，而且絕大部分定位于基因間隔區(qū)，其轉(zhuǎn)錄獨(dú)立于其他基因，且在進(jìn)化過程中保持高度保守。miRNA在表達(dá)上具有組織和時(shí)間的特異性，在生物體的各種生命活動(dòng)過程中發(fā)揮著重要作用。近年來，miRNA與糖尿病，尤其是DR的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)。本文主要就miRNA及其在DR中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 miRNA的發(fā)現(xiàn)

1998年美國(guó)科學(xué)家Fire和Mello發(fā)現(xiàn)dsRNA能誘導(dǎo)基因沉默，并因此榮獲2006年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。而早在1993年，Lee等［1］就已報(bào)道了第一個(gè)可定時(shí)調(diào)控胚胎后期發(fā)育的小分子RNA:lin-4。2000年Reinhart等［2］發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)類似的具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的小分子RNA:let-7。2001年Science報(bào)道了研究者從線蟲、果蠅和人體克隆的幾十個(gè)類似lin-4的小分子RNA基因，被命名為microRNA，即miRNA。2002年，miRNA的發(fā)現(xiàn)被美國(guó)著名雜志Science評(píng)為10大科技突破的第1名。

迄今為止，已經(jīng)在人類、果蠅、植物、細(xì)菌、病毒等多個(gè)生物物種中發(fā)現(xiàn)數(shù)千種miRNA。其中，僅miRBase 18.0中就收錄發(fā)夾前體序列18 226條，成熟miRNA 21 463條，共涵蓋168個(gè)物種。研究人員預(yù)測(cè)人類有超過30%蛋白編碼基因受到miRNA的調(diào)控。

2 miRNA的生物合成和作用機(jī)制

miRNA的表達(dá)受嚴(yán)格的調(diào)控，大多數(shù)基因位于染色體內(nèi)含子、基因間區(qū)域或不編碼mRNA的外顯子，在自己的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列控制下表達(dá)，另外一些miRNA在基因組中有多個(gè)位點(diǎn)，它們受到共同的調(diào)控并以多順反子的形式轉(zhuǎn)錄。但是不論其來自何處，其加工成熟機(jī)制都是相同的。miRNA基因通常是在核內(nèi)由RNA聚合酶II(pol II)轉(zhuǎn)錄的，最初產(chǎn)物為大的具有帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的具有莖-環(huán)的 miRNA基因轉(zhuǎn)錄體(pri-miRNA)。pri-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成一個(gè)長(zhǎng)度為60～70個(gè)核苷酸組成的具有特征莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA(precursor miRNA，pre-miRNA)。然后 Ran-GTP和 Exportin-5共同作用將pre-miRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中。隨后，另一個(gè)核酸酶Dicer將其剪切為約22 bp的二聚體RNA，這個(gè)二聚體RNA是由miRNA和長(zhǎng)度與其相似但不完全互補(bǔ)配對(duì)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的對(duì)側(cè)臂組成的。miRNA的對(duì)側(cè)臂通常被命名為 miRNA*，然后 miRNA:miRNA*二聚體很快被引導(dǎo)進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)中，其中一條成熟的單鏈miRNA保留在這一復(fù)合體中。成熟的miRNA結(jié)合到與其互補(bǔ)的mRNA的位點(diǎn)通過堿基配對(duì)調(diào)控基因表達(dá)［3-4］。前面所述的是在動(dòng)物中miRNA的產(chǎn)生過程，而在植物中miRNA的產(chǎn)生過程卻有所不同。植物中缺少Drosha同源異形體，pri-miRNA的兩次剪切加工都在核內(nèi)由Dicer酶的同源異形體DCL1催化完成，形成的miRNA/miRNA*二聚體由Exportin-5的同源異形體HASTY轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中與RISC復(fù)合物結(jié)合［5］。

最近的一些研究提示miRNA還有另外一種形成機(jī)制，稱作 mirtrons。這類 miRNA是 pre-miRNA的內(nèi)含子，這些miRNA不是從自身獨(dú)立的啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄而來，而是由一些內(nèi)含子加工形成。最先由內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄形成miRNA前體，然后再在Drosha酶的剪切作用下加工處理為成熟的miRNA［6-7］。成熟的miRNA和靶基因mRNA的3’UTR完全或不完全配對(duì)引起RISC降解目的mRNA片段或是阻礙其翻譯。miRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)后，除了阻遏翻譯外，還有引起mRNA快速脫腺苷酸化而被降解以抑制基因表達(dá)的作用［8］。最近也有研究表明，miRNA不僅可以和靶分子mRNA的3’UTR結(jié)合，還可以和編碼區(qū)及5’UTR結(jié)合。Tay等［9］的研究顯示，miRNA通過與靶分子mRNA的編碼區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的分化。Pan等［10］發(fā)現(xiàn)肝臟特有的miRNA-122與丙型肝炎病毒RNA 5’UTR區(qū)相互作用引起病毒增殖。研究發(fā)現(xiàn)，不同組織或細(xì)胞在不同階段表達(dá)著不同的miRNA譜。一個(gè)miRNA可調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)靶基因，包括細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等，miRNA與靶基因組成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)［11-12］。相對(duì)于蛋白水平的調(diào)節(jié)，miRNA水平的調(diào)節(jié)顯得更加節(jié)省能量，效率更高而且可逆，大多數(shù)miRNA對(duì)靶基因起著微調(diào)作用，少數(shù)miRNA調(diào)節(jié)也可引起很明顯的表型改變。

3 miRNA的功能和意義

miRNA作為一種新近發(fā)現(xiàn)的小分子RNA，其在生物體內(nèi)起著重要的作用，包括發(fā)育進(jìn)程、造血過程、器官形成、凋亡、細(xì)胞增殖和腫瘤的發(fā)生等。隨著檢測(cè) miRNA表達(dá)的方法日趨成熟，如 qRTPCR［13］、miRNA 芯片技術(shù)［14］、鎖定核酸的定量分析［15］等，對(duì)于miRNA的研究也有了較大的進(jìn)步，一些miRNA的功能已經(jīng)被我們所認(rèn)知。在哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育過程中，miRNA在組織分化中也起著較為重要的作用。大腦特異 miRNA，如 miRNA-9和miRNA-124a能夠影響體外培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞神經(jīng)譜系的分化。2006年，Schratt等［16］報(bào)道 miRNA-134在鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中對(duì)于神經(jīng)突觸的可塑性、發(fā)育成熟等方面具有特異性的調(diào)節(jié)作用。兩種miRNA在骨骼肌基因定向分化中發(fā)揮著作用，miRNA-1通過靶向抑制組蛋白脫乙?；?4轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)肌組織的形成，從而起到抑制骨骼肌基因轉(zhuǎn)錄的作用;miRNA-133則通過抑制血清反應(yīng)因子促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖［17］。

最近幾年，miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默與腫瘤形成的相關(guān)性已成為研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)在很多相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA對(duì)很多腫瘤相關(guān)基因具有抑制作用，并且被證實(shí)在未來對(duì)腫瘤的診斷和治療方面都有著不可估量的前景。例如miRNA-15a、miRNA-16和let-7在多種腫瘤中存在，并且均表現(xiàn)為下調(diào)，說明它們可作為腫瘤的抑制基因［18］。同時(shí)也有研究表明，miRNA也可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。Eis等［19］在B細(xì)胞淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，在各種類型的B細(xì)胞淋巴瘤組織中miRNA-155的表達(dá)較正常組織高10～30倍，且惡性程度越高、預(yù)后越差、彌散性大的B細(xì)胞淋巴瘤miRNA-155增高尤為顯著。Calin等［20］和 Volinia等［21］認(rèn)為 miRNA 表達(dá)差異可以用來正確區(qū)分不同種類及亞型的腫瘤，而且可以作為判斷腫瘤預(yù)后的輔助手段。研究顯示，let-7在肺癌中表達(dá)降低，其表達(dá)水平越低是腫瘤預(yù)后差的生物標(biāo)記［22］。

近年來，很多相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，一種miRNA可以參與數(shù)百種靶mRNA的調(diào)控［23］，其潛在的影響幾乎作用于每條基因通路;而很多種miRNA也可能同時(shí)作用于同一種mRNA［24］。根據(jù)miRNA在基因調(diào)控中的作用特點(diǎn)，設(shè)想應(yīng)用miRNA對(duì)疾病進(jìn)行治療時(shí)，可以“一石多鳥”，即可通過對(duì)某種特定miRNA進(jìn)行調(diào)控，從而達(dá)到治療多種疾病的效果;也可以“多石一鳥”，即可通過對(duì)一些相關(guān)的miRNA進(jìn)行調(diào)控，從而達(dá)到對(duì)某種特定疾病的治療效果。對(duì)miRNA基因表達(dá)調(diào)控功能及其作用機(jī)制的進(jìn)一步研究，將對(duì)基因功能研究、生物進(jìn)化探索和人類疾病防治具有重大意義。

4 miRNA與DR

DR是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，其主要的特征是視網(wǎng)膜微血管功能障礙，最嚴(yán)重的后果是導(dǎo)致失明，它已成為大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家工作年齡人群致盲的首要原因。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者比非糖尿病患者發(fā)生視力損害的危險(xiǎn)性高25倍［25］，每年僅在美國(guó)就有12 000～24 000例患者因DR而失明［26］。DR發(fā)生的確切機(jī)制目前仍未完全清楚。就當(dāng)前的研究而言，DR是一個(gè)多基因、多階段的疾病，其病理改變涉及代謝酶、炎癥、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)及離子通道等相關(guān)基因的變化。由于DR的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，其確切有效的治療方法也沒有最終明確。學(xué)者們普遍認(rèn)為早期有效控制血糖、血壓和血脂是治療DR的關(guān)鍵措施;而激光光凝術(shù)和玻璃體切割術(shù)是手術(shù)治療DR、預(yù)防新生血管形成的有效措施［27］。但是，這些方法均不能完全有效阻止視網(wǎng)膜新生血管的形成。miRNA與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系，進(jìn)一步研究miRNA對(duì)DR新生血管的調(diào)節(jié)作用，對(duì)于深入探討該疾病的致病機(jī)制及開發(fā)治療新藥有著長(zhǎng)遠(yuǎn)的意義。

近年來，一些研究表明很多特異性的miRNA在眼球組織包括角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜中均有特定性的表達(dá)，并具有一定特點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA-9、miRNA-23b、miRNA-26a、miRNA-30c、miRNA-125b、miRNA-181、miRNA-182、miRNA-183、miRNA-184、miRNA-204、miRNA-205、miRNA-210、miRNA-211、miRNA-219、miRNA-320在視網(wǎng)膜組織中均有特異性的表達(dá)［28-31］。深入研究這些miRNA的時(shí)間及空間分布對(duì)于進(jìn)一步研究它們的作用靶點(diǎn)及它們?nèi)绾斡绊懸暰W(wǎng)膜的發(fā)育和功能，以及它們?nèi)绾卧贒R中起調(diào)節(jié)作用，對(duì)治療DR至關(guān)重要。Arora等［30］認(rèn)為許多miRNA在視網(wǎng)膜中具有調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜功能的重要作用。各物種間視網(wǎng)膜miRNA具有較高的保守性，miRNA改變可能導(dǎo)致視覺功能的破壞。他還對(duì)人及鼠視網(wǎng)膜miRNA表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜組織中有67種miRNA可對(duì)以往報(bào)道的320種視網(wǎng)膜基因中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)行調(diào)節(jié)。Kovacs等［32］采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，通過與對(duì)照組對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)在兩組視網(wǎng)膜中有350種miRNA，其中86種miRNA表達(dá)有差異;視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)出220種miRNA，其中120種miRNA表達(dá)有差異。通過基因功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-146通過作用于白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6，抑制了核轉(zhuǎn)錄因子-κB的活化。與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)有關(guān)的miRNA-17-5p、miRNA-18a、miRNA-20a、miRNA-21、miRNA-31、miRNA-155等的表達(dá)都有增加。與p53相作用的miRNA-34家族在糖尿病組的表達(dá)上調(diào)，表明p53依賴的miRNA-34介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能在早期DR中起到重要作用。

目前，已有較多miRNA作用于視網(wǎng)膜新生血管機(jī)制方面的研究報(bào)道。Kuehbacher等［33］采用在體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和在裸鼠皮下注射經(jīng)過RNA干擾技術(shù)抑制Dicer酶和Drosha酶處理的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，通過進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)新生血管萌芽及管壁的形成被明顯地抑制，其中抑制Dicer酶組在體內(nèi)體外都明顯地抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的移行，但抑制Drosha酶組在體外作用甚微，體內(nèi)則無此作用。通過體外細(xì)胞miRNA的提取分析，共有168種miRNA表達(dá)，其中發(fā)現(xiàn) let-7家族、miRNA-21、miRNA-126、miRNA-221和miRNA-222在血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有較高水平的表達(dá)，抑制Dicer和Drosha酶后，let-7家族和miRNA-27b的高表達(dá)被抑制，同時(shí)采用let-7家族和miRNA-27b的抑制劑也可抑制新生血管管壁的形成，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些作用都與血小板反應(yīng)素-1有關(guān)，因此認(rèn)為let-7家族和miRNA-27b與新生血管的發(fā)生有密切的關(guān)系。McArthur等［34］利用基因芯片技術(shù)，對(duì)已經(jīng)出現(xiàn)DR的大鼠視網(wǎng)膜和高糖刺激下的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比篩查，發(fā)現(xiàn)miRNA-200b的表達(dá)顯著增高，同時(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的mRNA和蛋白表達(dá)也增高。在視網(wǎng)膜中，miRNA-200b定位于神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。通過基因干擾技術(shù)阻斷miRNA-200b的表達(dá)，可明顯降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA和蛋白的表達(dá);同時(shí)也阻礙了糖尿病引起的視網(wǎng)膜血管通透性的增加和新生血管的生成。因此，針對(duì)miRNA的研究可能成為未來DR治療的新靶點(diǎn)。

5 展望

miRNA的發(fā)現(xiàn)為中心法則中RNA次要中介作用提供了重要補(bǔ)充，為非編碼RNA參與基因調(diào)控提供了一個(gè)很好的范例。目前，雖然人類對(duì)miRNA及其在DR領(lǐng)域的研究已取得一些進(jìn)展，但僅是冰山一角，仍需進(jìn)行更為深入與廣泛的研究。miRNA在DR中的研究目前還面臨很多問題。例如，如何準(zhǔn)確地分離miRNA分子，miRNA與靶mRNA之間的調(diào)控關(guān)系，miRNA之間是否也存在可相互調(diào)控的關(guān)系，如何尋找在DR中的特異的miRNA表達(dá)譜，怎樣開發(fā)出與之相應(yīng)的有效藥物等。基因芯片和生物信息學(xué)是近年來新發(fā)展起來的科學(xué)技術(shù)，運(yùn)用生物信息學(xué)和miRNA基因芯片技術(shù)將有助于新miRNA的鑒別及其功能鑒定、靶基因的預(yù)測(cè)，以及相應(yīng)藥物的研發(fā)。這必將對(duì)DR的研究、預(yù)防和治療掀開新的篇章。

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