單抗藥物組織交叉反應(yīng)中不同免疫組織化學(xué)方法的比較性研究

林 志 呂建軍 屈 哲 李珊珊 張 迪 楊艷偉 李 波

單克隆抗體類藥物作為一種新型的生物技術(shù)藥物具有特定的免疫性。如果除了與適應(yīng)證相關(guān)本身特定的靶器官外，人體正常組織細(xì)胞中存在相同或相似的抗原決定簇，單克隆抗體類藥物則可能會與非靶器官外的其他組織或細(xì)胞結(jié)合，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)［1］。因此單克隆抗體類藥物的免疫交叉反應(yīng)在藥物臨床前的安全性評價中非常重要。根據(jù)FDA的相關(guān)規(guī)定，抗體類藥物的免疫交叉反應(yīng)常常采用正常成人組織或相應(yīng)的細(xì)胞株進行免疫組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)試驗［2］。然而，單克隆抗體藥物作為一種創(chuàng)新的生物技術(shù)藥物，尤其是全人源化單抗藥物的研發(fā)，其人體組織交叉反應(yīng)在技術(shù)上仍存在很多困難，如何采用合適的免疫組織化學(xué)的方法是我們需要深入討論的問題［3］。本文擬通過兩種不同的單克隆抗體藥物進行組織交叉反應(yīng)的比較研究，以探討免疫組織化學(xué)常規(guī)二步法和直接法在人體組織交叉反應(yīng)研究中的應(yīng)用。

材料與方法

1.單克隆抗體的準(zhǔn)備:實驗采用了兩種不同的單克隆抗體藥物，分別為貝伐單抗(抗血管內(nèi)皮生長因子受體單克隆抗體)和美羅華(抗CD20單克隆抗體，羅氏公司)。其中貝伐單抗為全人源化單克隆抗體，美羅華為人鼠嵌合型單克隆抗體。根據(jù)各抗體的預(yù)實驗結(jié)果，采用不同的抗體最佳濃度進行多種免疫組織化學(xué)方法的比較研究(表1)。

表1 不同免疫組織化學(xué)方法中兩種抗體的最佳濃度*

2.正常人體組織以及腫瘤組織的準(zhǔn)備:貝伐單抗是抗血管內(nèi)皮生長因子受體單克隆抗體(VEGF)，因此相應(yīng)選用高表達VEGF的人血管肉瘤組織(由南京醫(yī)科大學(xué)提供)作為實驗對象。美羅華是抗B淋巴細(xì)胞表面抗原CD20的單克隆抗體，因此相應(yīng)選用人淋巴結(jié)(由中國食品藥品檢定研究院提供)作為實驗對象。上述組織通過相關(guān)抗體證實其對應(yīng)抗原均保存良好。

3.免疫組織化學(xué)方法:(1)常規(guī)二步法:正常人體組織或腫瘤組織組織切片脫蠟水化;3%H2O2作用10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;蒸餾水洗，PBS浸泡5min;微波抗原修復(fù)10min;蒸餾水及PBS漂洗;正常羊血清工作液封閉，放置37℃溫箱孵育60min;滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜;PBS漂洗;滴加二抗(貝伐單抗為全人源化單抗，對應(yīng)二抗為羊抗人多克隆抗體，北京中杉金橋有限公司提供;美羅華為人鼠嵌合型單抗，對應(yīng)二抗為羊抗鼠F(ab)多克隆抗體，PIERCE公司提供)，37℃溫箱孵育60min;貝伐單抗采用DAB溶液顯色，美羅華采用堿性磷酸酶顯色;脫水透明后封片。(2)直接法:正常人體組織或腫瘤組織組織切片脫蠟水化;3%H2O2作用10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;蒸餾水洗，PBS浸泡5min;微波抗原修復(fù)10min;蒸餾水及PBS漂洗;正常羊血清工作液封閉，放置37℃溫箱孵育60min;內(nèi)源性生物素封閉;滴加生物素標(biāo)記的一抗，4℃冰箱孵育過夜;PBS漂洗;滴加鏈酶卵白素(streptavidin-HRP)，37℃溫箱孵育60min;DAB溶液顯色;蘇木精復(fù)染，自來水洗，鹽酸乙醇分化，返藍;脫水透明后封片。

4.免疫組織化學(xué)方法評分:貝伐單抗以腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號，美羅華以淋巴結(jié)B淋巴細(xì)胞胞膜出現(xiàn)藍色顆粒為陽性信號。按Breasalier等［4］的方法判斷染色結(jié)果。在每張切片隨機選取10個視野，根據(jù)細(xì)胞染色強度分為4級，并分別記分，陰性:細(xì)胞無著色(0分)，弱陽性:淺黃色或淺藍色(1分)，中度陽性:棕黃色或藍色(2分)，強陽性:深棕黃色或深藍色(3分)。計算每一染色強度的細(xì)胞占視野的百分?jǐn)?shù)，根據(jù)下列公式計算平均染色強度(insensity score)，IS=∑{〔0×F0〕+〔1×F1〕+〔2×F2〕+〔3×F3〕}，式中，F(xiàn)=每一強度細(xì)胞所占視野百分?jǐn)?shù)×10視野。

5.統(tǒng)計學(xué)方法:所有實驗均重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.貝伐單抗不同免疫組織化學(xué)方法的結(jié)果:采用直接法進行貝伐單抗的組織交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示陰性對照組背景干凈，血管肉瘤未著色，為陰性表達(圖1A)。實驗組采用生物素標(biāo)記后的20μg/ml貝伐單抗，血管肉瘤組織呈深棕黃色，為強陽性表達(圖1B)。采用常規(guī)免疫組織化學(xué)二步法進行貝伐單抗的組織交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示陰性對照組血管肉瘤組織中淋巴細(xì)胞及纖維組織呈淺黃色，為弱陽性表達，腫瘤細(xì)胞未著色(圖1C)。實驗組采用200μg/ml貝伐單抗，血管肉瘤組織呈淺黃色，為弱陽性表達(圖1D)。如圖所示直接法可以有效地減低背景的非特異性染色，并且提高實驗的靈敏度，僅在20μg/ml就顯示出較好的染色結(jié)果。比較兩種方法，直接法中實驗組血管肉瘤組織的平均染色強度與陰性對照組存在顯著性差異(P＜0.01)，而常規(guī)二步法中實驗組血管肉瘤組織的平均染色強度與陰性對照組差異不明顯(圖2)。

圖1 貝伐單抗組織交叉反應(yīng)不同方法的比較(×200)

圖2 貝伐單抗的組間平均染色強度差異性比較

2.美羅華不同免疫組織化學(xué)方法的結(jié)果:美羅華為抗CD20單克隆抗體，因此該抗體能與淋巴濾泡中的B細(xì)胞結(jié)合。采用直接法進行美羅華的組織交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示陰性對照組背景干凈，淋巴結(jié)濾泡(B細(xì)胞)及髓竇內(nèi)未著色，為陰性表達(圖3A和圖3C)。實驗組采用生物素標(biāo)記后的100μg/ml美羅華，僅在淋巴結(jié)髓竇內(nèi)見巨噬細(xì)胞呈深棕黃色，為強陽性表達(圖3D)。采用常規(guī)免疫組織化學(xué)二步法進行美羅華的組織交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示陰性對照組淋巴結(jié)未著色(圖3E)。實驗組采用20μg/ml美羅華，淋巴結(jié)濾泡(B細(xì)胞)呈藍色，為陽性表達(圖3F)。如圖3所示，直接法未能有效地顯示美羅華與B細(xì)胞的結(jié)合，反而出現(xiàn)了髓竇巨噬細(xì)胞非特異性染色。常規(guī)二步法美羅華僅在20μg/ml就顯示出特異性的染色結(jié)果，淋巴濾泡B細(xì)胞呈藍色，為陽性表達。

討 論

1975年Kohler和Milstein創(chuàng)立了雜交瘤技術(shù)，為單克隆抗體的研制和開發(fā)揭開了序幕。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日臻完善，完全人源化抗體已經(jīng)實現(xiàn)，即通過滅活小鼠內(nèi)源性免疫球蛋白基因，再將人免疫球蛋白基因嵌于其基因組后產(chǎn)生［5］。由于該類生物技術(shù)藥物在疾病治療中廣闊的應(yīng)用前景，單克隆抗體藥物成為了各國科學(xué)家研究的重要領(lǐng)域［6，7］。

圖3 美羅華組織交叉反應(yīng)不同方法的比較(×200)

如果人體正常組織細(xì)胞中存在相同或相似的抗原決定簇，單克隆抗體類藥物則可能會與非靶器官外的其他組織或細(xì)胞結(jié)合，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此單克隆抗體類藥物的組織交叉反應(yīng)在藥物臨床前的安全性評價中非常重要［8］。免疫組織化學(xué)在很多技術(shù)上存在困難［9，10］。尤其是最近以來，完全人源化單克隆抗體藥物的研發(fā)成為熱點，這使得人源化單抗進行免疫組織化學(xué)研究中所選用的二抗為羊抗人抗體。因此，正常人組織能與二抗(抗人組織抗體)結(jié)合造成背景非特異性染色增強，很大程度上干擾了實驗結(jié)果。盡管有部分文獻提供了一些解決辦法，如采用與待測組織相同的5%的正常血清(人血清)稀釋二抗;采用經(jīng)胃蛋白酶消化處理二抗使其不含F(xiàn)c段;采用二抗相同種族的正常血清封閉切片等［11，12］。但是這只能部分解決非特異性染色的問題，目前仍沒有可接受的辦法。

本文通過兩種不同類型的單克隆抗體藥物貝伐單抗和美羅華，分別采用了常規(guī)二步法和直接法，進行了人體組織交叉反應(yīng)。實驗結(jié)果表明貝伐單抗采用直接法，能夠有效地顯示出與血管肉瘤組織的結(jié)合，其特異性及敏感性都遠(yuǎn)高于常規(guī)二步法。直接法采用生物素化的抗體，避免了抗人二抗的使用，減少了二抗與人體組織的非特異性結(jié)合。此外，通過鏈酶卵白素放大系統(tǒng)，放大了抗體與組織結(jié)合的效力。然而，美羅華實驗卻反應(yīng)出相反的結(jié)果。生物素直接標(biāo)記的美羅華與淋巴結(jié)B細(xì)胞未見結(jié)合，反而在髓竇內(nèi)巨噬細(xì)胞出現(xiàn)非特異性的結(jié)合。采用常規(guī)二步法，美羅華與淋巴結(jié)B細(xì)胞出現(xiàn)特異性結(jié)合，并且由于美羅華是人鼠嵌合型單抗，二抗采用抗鼠的二抗，有效地減低了背景性的染色。

直接法與常規(guī)二步法對于單抗藥物的組織交叉反應(yīng)各有利弊。直接法的優(yōu)勢在于其能有效地避免抗人抗體作為二抗的使用，從而降低了背景染色，有利于最終結(jié)果的判定。然而，生物素直接標(biāo)記后無法確定是否改變了受檢單抗的結(jié)構(gòu)特征，因而修飾過的抗體可能與其他非特異性抗原結(jié)合，提高實驗的假陽性。常規(guī)二步法的優(yōu)點在于直接受檢的單抗為一抗，因此抗體的特征與最終臨床使用的抗體藥物一致，結(jié)果最為真實地反映了藥物與靶位抗原的結(jié)合情況。但是，隨著全人源化單抗的日益增多，在常規(guī)二步法中需要應(yīng)用抗人抗體作為二抗，這屆不可避免的造成二抗直接與人體組織標(biāo)本的非特異性抗原結(jié)合，從而使得背景染色增強，干擾了最終結(jié)果的判定。

本文通過不同實驗方法的比較，采用兩種不同的單抗，發(fā)現(xiàn)不同的單抗適用不同的試驗方法。一般而言，以下循序適用于初次研究者進行人體組織交叉反應(yīng)研究，即先采用常規(guī)二步法，如果背景染色過強時考慮換用直接法。最終試驗方法的確定取決于該單抗的組織交叉反應(yīng)結(jié)果。有文獻報道，常規(guī)二抗法中二抗的選擇非常重要，避免選用Fc段的二抗可以在一定程度上改善結(jié)果［13～15］。當(dāng)檢測抗體為全人源化抗體時，可以采用抗獨特型抗體作為二抗進行組織交叉反應(yīng)。但是仍需要注意抗獨特型抗體是否結(jié)合內(nèi)源性的IgG，并確定其不會改變測試抗體的親和力。在采用生物素標(biāo)記抗體進行免疫組織化學(xué)染色時有兩個問題需要考慮:第一是必須對陰性對照抗體同時進行生物素標(biāo)記，第二必須在加一抗前阻斷內(nèi)源性的生物素。通常阻斷采用卵白素和生物素，并且需要采用去除一抗的染色以平行比較內(nèi)源性生物素結(jié)合的情況?？傊?，組織交叉反應(yīng)作為單克隆藥物的臨床前安全性評價的重要組成部分，只有提高是建立和完善該類創(chuàng)新生物技術(shù)藥物的臨床前安全性評價體系的基礎(chǔ)，才能促進我國生物技術(shù)藥物的蓬勃發(fā)展。

1 王軍志.生物技術(shù)藥物研究開發(fā)和質(zhì)量控制［M］.北京:北京科學(xué)出版社，2007:363

2 U S Food and Drug Administration Center for Biologics Evaluation and Research.Points to consider in the manufacture and testing of monoclonal antibody products for human use［J］.J Immunother，1997，20(3):214-243

3 Johnson CW.Issues in immunohistochemistry［J］.ToxicolPathol，1999，27(2):246-248

4 Bresalier RS，Ho SB，Schoeppner HL，et al.Enhanced sialylation of mucin-associated carbohydrate structures in human colon cancer metastasis［J］.Gastroenterology，1996，110(5):1354-1367

5 Davis CG，Gallo ML，Corvalan JRF.Transgenic mice as a source of fully human antibodies for the treatment of cancer［J］.Cancer and Metastasis，1999，12(18):421

6 姜倩倩，劉京貞，蘇瑞強.單克隆抗體藥物進展［J］.藥物生物技術(shù)，2005，12(4):270-274

7 沈倍奮.抗體藥物研究進展［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2002，23(10):1047

8 林志.免疫交叉反應(yīng)在單克隆抗體類藥物臨床前安全性評價中的應(yīng)用［J］.毒理學(xué)雜志，2007，21(4):303

9 Taylor CR，Levenson RM.Quantification of immunohistochemistryissues concerning methods，utility and semiquantitative assessment II［J］.Histopathology，2006，49(4):411-424

10 Taylor CR.Focus on biospecimens:the issue is the tissue［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2011，19(2):95-98

11 Naseri M，Moazzeni SM，Pourfathollah AA.APAAP complex:Production and usage in immunocytochemical and immunohistochemical staining［J］.Hum Antibodies，2007，16(3-4):107-115

12 Vosse BA，Seelentag W，Bachmann A，et al.Background staining of visualization systems in immunohistochemistry:comparison of the Avidin-Biotin Complex system and the EnVision+system［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2007，15(1):103-107

13 Cavagnaro JA.Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals:a since-based approach to facilitating clinical trials［M］.John Wiley Sons Inc，2008:207-239

14 Goldstein NS，Hewitt SM，Taylor CR，et al.Recommendations for improved standardization of immunohistochemistry［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2007，15(2):124-133

15 Skaland I，Nordhus M，Gudlaugsson E，et al.Evaluation of 5 different labeled polymer immunohistochemical detection systems［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2010，18(1):90-96