柴胡皂苷-d 對大鼠肝癌細胞H4-ⅡE 細胞內(nèi)Ca2+的影響研究

秦 勇 陳念平 葉冠雄 徐勝前 吳成軍 王 世 潘德標

膽汁酸可通過誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中Ca2+的釋放和(或)鈣內(nèi)流，改變細胞內(nèi)鈣離子濃度(［Ca2+］cyt)，來加強或抑制膽汁沿著膽道系統(tǒng)進行排泄，調(diào)節(jié)肝細胞一系列生理功能［1～3］。我國中藥柴胡在臨床應用中發(fā)揮不同的作用，柴胡皂苷是柴胡的主要化學成分，Yang等研究發(fā)現(xiàn)10μmol/L柴胡皂苷(I)能誘導大鼠胰腺腺泡細胞內(nèi)鈣庫中Ca2+釋放，增加細胞內(nèi)Ca2+濃度，隨后又出現(xiàn)胞外Ca2+內(nèi)流，再次增加胞內(nèi)Ca2+濃度［4～6］。而在隨后的研究中證實，柴胡皂苷(I)通過與大鼠胰腺腺泡細胞膜受體的相互作用轉導刺激信號，使［Ca2+］i先后兩次達到峰值，從而持續(xù)加強柴胡皂苷(I)的促酶分泌功能。日本學者Kodama等［7］對C6型大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的研究中發(fā)現(xiàn)10～100μmol/L柴胡皂苷－d可誘導細胞內(nèi)鈣庫中Ca2+釋放，使細胞內(nèi)Ca2+濃度升高。綜合上述學者的研究，柴胡皂苷－d可調(diào)控細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，但能否誘導肝細胞系內(nèi)Ca2+濃度的變化在國內(nèi)少見報道，本實驗在細胞水平上探討SS－D對H4－ⅡE細胞內(nèi)Ca2+濃度變化影響作用。

資料與方法

1．細胞株:大鼠肝癌細胞株H4－ⅡE購自上海拜力生物科技有限公司。

2．試劑和儀器:DMEM培養(yǎng)基(廣州威佳公司)，石膽酸、熊脫氧膽酸(Sigma公司)，柴胡皂苷－d(南昌貝塔公司)，F(xiàn)luo－3/AM熒光探針(香港先進技術公司)。

3．細胞培養(yǎng):大鼠肝癌細胞株H4－ⅡE接種于含10%胎牛血清、100U/L青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每1～2天換液傳代培養(yǎng)。傳代時將原培養(yǎng)液吸出，加入0．25%胰蛋白酶溶液消化45s后，加入5ml左右的新培養(yǎng)液終止消化，然后用培養(yǎng)液吹打制成細胞懸液后傳代或接種。

4．實驗分組:第一大組:處理組為柴胡皂苷－d樣品液加入培養(yǎng)液中，終濃度分別為處理組1(30μmol/L)、處理組2(50μmol/L)、處理組 3(70μmol/L)、處理組 4(100μmol/L)，同時每個處理組都加入終濃度為50μmol/L石膽酸(LCA);空白對照組:加入與處理組相同體積完全培養(yǎng)液(大鼠肝癌細胞H4－ⅡE);陰性對照組:終濃度為50μmol/L LCA加入與處理組相同體積培養(yǎng)液中;陽性對照組:終濃度為300μmol/L熊脫氧膽酸(UDCA)與終濃度為50μmol/L LCA同時加入與處理組相同體積培養(yǎng)液中。第二大組又分別設立空白對照組、終濃度為50μmol/L的LCA為陰性對照組、300μmol/L的UDCA為陽性對照組及50μmol/L的SS－D為處理組。

5．噻唑藍(MTT)比色實驗:取對數(shù)生長期生長良好的H4－ⅡE肝癌細胞以6×103/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每組設5個平行孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后(待完全貼壁)，換含有不同濃度的柴胡皂苷－d及對照組的H4－ⅡE肝癌細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12h后，后進行MTT染色分析

6．熒光指示劑Fluo－3/AM結合流式細胞儀測定細胞內(nèi)鈣離子濃度:①將濃度為5×105個/毫升的H4－ⅡE肝癌細胞接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后換液，第一大組及第二大組各實驗組同時作用細胞12h后，無Ca2+的D－Hank's離心洗滌1000r/min×5min×3次，棄上清液，收集細胞(2～3)×106個細胞;②第一大組避光加入1ml終濃度為2．4mmol/L的Ca2+及5μmol/L熒光染料Fluo－3/AM孵育緩沖液懸浮細胞;37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光孵lh;③第二大組避光先加入lm l無Ca2+、pH值為8．8、終濃度為20mmol/L的乙二醇雙四乙酸(EGTA)及5μmol/L熒光染料Fluo－3/AM孵育緩沖液懸浮細胞;37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育1h。選用各實驗分組作用于大鼠肝癌細胞株H4－ⅡE12h后，按照試劑盒上的說明書結合流式細胞儀檢測H4－ⅡE細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。

結 果

1．噻唑藍(MTT)比色實驗選擇藥物實驗濃度:不同濃度的SS－D處理H4－ⅡE肝癌細胞12h后，SS－D對肝癌細胞的抑制作用不大，最大抑制率不超過11．12%;說明10～100μmol/L SS－D 對細胞的生長無明顯影響(表1)。SS－D不同濃度時細胞的存活率見表1，為避免藥物濃度過大所致的細胞毒性作用，應選擇對細胞生長無明顯影響即細胞存活率在90%以上的濃度。

表1 柴胡皂苷-d組對H4-ⅡE肝癌細胞活性的影響(±+s)

表1 柴胡皂苷-d組對H4-ⅡE肝癌細胞活性的影響(±+s)

與對照組比較，★P＜0．05;與120μmol/L柴胡皂苷 －d組比較，▲P ＜0．05

組別 濃度(μmol/L) OD值 存活率(%)88．88 0．8208 ±0．0517柴胡皂苷 －d組 10 0．7810 ±0．0323▲★ 94．95 30 0．7730 ±0．0296▲★ 93．94 50 0．7676 ±0．0229▲★ 93．25 70 0．7610 ±0．0204▲★ 92．92 100 0．7622 ±0．0344▲★ 92．57 120 0．7702 ±0．0234★對照組

2．熒光指示劑Fluo－3/AM測定細胞內(nèi)鈣離子濃度:分析結果以1萬個細胞平均熒光強度 (mean fluorescence intensity，MFI)表示細胞內(nèi)鈣離子的相對含量，結果顯示第一大組中陰性對照組處理H4－ⅡE細胞12h后可引起細胞內(nèi)Ca2+的MFI升高，陽性對照組可使細胞內(nèi)Ca2+的MFI大幅度升高，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。處理組也可使細胞內(nèi)鈣離子的MFI不同程度升高，并且與SS－D呈濃度依賴性，與陰性對照組比較有差異(P＜0．05);處理組1、處理組3、處理組4與陽性對照組比較有差異(P＜0．05)，并且與SS－D呈濃度依賴性。第二大組中陰性、陽性及處理組都能使細胞內(nèi)Ca2+的MFI增加，說明SS－D、LCA及UDCA都能誘導鈣庫中鈣離子釋放到胞質(zhì)中。

3．流式細胞儀圖觀察各實驗組Ca2+的變化情況:圖1 中 A、B、D、E、F、G 各波峰代表進入?yún)^(qū)域的熒光數(shù)目，橫線代表熒光強度;A組未見進入熒光強度區(qū)域內(nèi)的波峰，G及C組也可見不同程度進入熒光強度區(qū)域內(nèi)的波峰，而隨著處理組濃度的增加，進入橫線區(qū)域的波峰也增多，說明熒光強度及量呈不同程度

圖1 石膽酸、熊脫氧膽酸、柴胡皂苷-d對H4-ⅡE細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

討 論

鈣離子是細胞內(nèi)的主要第二信使，參與調(diào)控許多細胞和組織的生理活動，近期研究膽汁酸對大鼠肝癌細胞H4－ⅡE和原代正常的鼠肝細胞的作用，發(fā)現(xiàn)UDCA及其他的利膽膽汁酸，能誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫中Ca2+釋放，激活 Ca2+內(nèi)流［3，8］。而預培養(yǎng) 12h 的 LCA及其他淤膽膽汁酸也可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫中Ca2+釋放，但抑制Ca2+內(nèi)流，利膽膽汁酸牛磺脫氧膽酸(TDCA)與淤膽膽汁酸LCA同時行細胞培養(yǎng)12h后，細胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高，這提示TDCA能抵消預培養(yǎng)12h的LCA對鈣池操作性鈣通道(SOC)的抑制作用，說明利膽膽汁酸能中和淤膽膽汁酸對細胞的毒害作用［3］。柴胡皂苷－d是柴胡化學成分中最具有活性的成分，能否誘導肝細胞系內(nèi)Ca2+的變化，在國內(nèi)研究甚少［4］。

本實驗通過30～100μmol/L柴胡皂苷－d(SSD)加50μmol/L LCA作為處理組、UDCA加LCA作為陽性對照組及LCA作為陰性對照組同時孵育大鼠肝癌細胞 H4－ⅡE 12h后，結果顯示 LCA可引起［Ca2+］cyt升高，UDCA可使其大幅度升高，不同濃度的SS－D也可使其不同程度升高，并且與SS－D呈濃度依賴性，而50μmol/L的LCA、300μmol/L的UCDA及50μmol/L的SS－D作用于大鼠肝癌細胞H4－ⅡE 12h后都能使［Ca2+］cyt增加，說明SS－D與利膽膽汁酸具有相同作用，而有研究在膽汁淤積癥鼠模型中證實，利膽膽汁酸能預防膽管細胞受損，維持其正常的功能活動［9］。又有研究表明，肝細胞內(nèi)胞質(zhì)中游離Ca2+濃度的升高是由于胞外Ca2+內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫中Ca2+的釋放所致，而這又是膽管收縮，促使膽汁酸沿著膽小管移動的必需的部分機制。而SSD對乙醇損傷大鼠肝細胞研究表明，SS－d能增強機體抗氧化防御能力［10］。抑制自由基的產(chǎn)生，促進肝細胞增殖，防止肝細胞損傷和壞死。這更進一步說明SS－D可能通過影響細胞內(nèi)Ca2+變化來刺激膽汁流量，在分子水平上減少氧自由基的產(chǎn)生，從而起到保護肝細胞內(nèi)能量代謝、減輕肝臟損傷的作用。

綜上所述，結合本次實驗，是否可推測SS－D可能作為一種“天然的利膽藥”，在膽汁淤積癥中或肝內(nèi)外膽道梗阻解除的情況下，通過誘導細胞內(nèi)鈣庫中Ca2+的釋放來提高胞質(zhì)中鈣離子濃度，加強膽汁排泄。但SS－D在調(diào)控細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化是否與膜上的鈣信號通路有關，值得更進一步研究。

1 Lau BW，Colella M，RuderWC，etal．Deoxycholic acid activates protein kinase C and phospholipase C via increased Ca2+entry at plasma membrane［J］．Gastroenterology，2005，128(3):695 －707

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3 Aromataris EC，Castro J，Rychkov G，et al．Storeoperated Ca2+channels and stromal interaction molecule 1(STIM1)are targets for the actions of bile acids on liver cells［J］．Biochim Biophys Acta Mol Cell Res，2008，1783(5):874 －885

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5 YangWX，Yu Y，ZhangWZ，et al．Inhibitory role of GDP on saikosaponin(I)stimulated enzymes secretion and rising of［Ca2+］i in rat pancreatic acini［J］．Acta Pharmacol Sin，2001，22(7):669 － 672

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10 李素婷，周曉慧，楊鶴梅，等．柴胡皂苷－d對乙醇損傷原代培養(yǎng)大鼠肝細胞的保護作用［J］．承德醫(yī)學院院報，2007，24(4):352－354