Bcl-2蛋白對自噬和凋亡的調控及其相關機制

董 琳 童 煜 毛 萌

凋亡和自噬是真核生物中重要的生理和病理現(xiàn)象，在哺乳動物發(fā)育，維持細胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用，并與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關。兩者在形態(tài)學、信號通路及生化代謝途徑方面有著顯著區(qū)別。凋亡的典型特征是胞質皺縮，核固縮，DNA降解，凋亡小體形成，而殘余的細胞會被吞噬細胞識別、吞噬并降解;自噬以包裹胞質內容物的雙層膜結構的自噬小體出現(xiàn)為標志，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體。自噬在決定細胞命運時具有兩面性:一方面，過度激活自噬會導致細胞死亡;另一方面，自噬也可作為細胞的自救行為，在某些病理狀態(tài)下(如饑餓、生長因子剝奪、缺氧缺血等)通過降解胞質內容物維持自身存活。目前認為，凋亡和自噬有著潛在聯(lián)系。Bcl－2蛋白是一個與凋亡和自噬均密切相關的蛋白。近年來，隨著對Bcl－2蛋白構象與功能的進一步研究，發(fā)現(xiàn)其在凋亡和自噬過程中具有雙重調控的功能，并介導兩者之間的交織和串流。本文重點綜述Bcl－2蛋白在凋亡和自噬調控中的相關機制及其內在聯(lián)系。

一、Bcl-2蛋白及其亞細胞定位

Bcl－2蛋白是Bcl－2原癌基因的編碼產物，是細胞存活促進因子，屬膜整合蛋白，分子質量為26kDa，定位于線粒體、內質網和連續(xù)的核周膜，是Bcl－2家族中的抗凋亡蛋白成員，其多肽鏈中含有4個保守的α螺旋結構域(BH1－BH4)。Bcl－2蛋白定位于細胞的不同部位，其分子構象在不用的因素作用下可發(fā)生改變導致亞細胞定位發(fā)生變化，或在細胞的不同部位與其他蛋白相互作用，從而在凋亡和自噬中起調控作用。

線粒體是Bcl－2家族成員發(fā)揮調控凋亡作用的重要細胞器。Bcl－2家族是凋亡通路的關鍵分子，通過抗凋亡和促凋亡蛋白之間的相互作用，影響線粒體結構和功能的穩(wěn)定性［1］。在凋亡相關信號刺激后，促凋亡蛋白發(fā)生一系列改變(如Bax構象變化，Bid和Bim裂解效應，Bad、Bik的磷酸化調節(jié)等)，并向線粒體外膜靶向異位，導致線粒體通透轉換孔的開放，釋放促凋亡因子，激活caspase級聯(lián)，執(zhí)行細胞凋亡?？沟蛲龅鞍譈cl－2對凋亡的拮抗作用也發(fā)生在線粒體膜上，膜蛋白分子表面的疏水凹槽可以容納促凋亡Bcl－2家族成員的BH3結構域，使其不能有效的發(fā)揮促凋亡活性。

近來研究顯示，抗凋亡蛋白Bcl－2對自噬的調節(jié)具有細胞器特異性。只有定位于內質網，而非線粒體的抗凋亡蛋白Bcl－2能與beclin1形成復合體，對自噬起負調節(jié)作用［2］?？梢姡珺cl－2蛋白參與凋亡和自噬的調節(jié)，其構象改變和亞細胞定位的變化對其生物功能的發(fā)揮起著重要作用。

二、Bcl-2蛋白在細胞自噬中的調控作用

Beclin 1(在哺乳動物細胞中與酵母自噬基因Atg6同源)是與Bcl－2相互作用參與自噬調控的重要因子。beclin 1參與形成Ⅲ型PI3K復合物，引導自噬相關蛋白向自噬體膜靶向定位，從而促使自噬體雙層膜形成?；蚯贸∈笈咛ジ杉毎蟀l(fā)現(xiàn)，beclin 1－/－小鼠在胚胎早期全部死亡，雜合子(beclin 1+/－)的小鼠可以存活，但體內Beclin 1蛋白表達顯著降低，導致其自噬功能的削弱及自發(fā)腫瘤的發(fā)生顯著升高。由此beclin 1作為新型的僅包含BH3的Bcl－2蛋白家族成員，也是一個單倍不足的抑癌基因，在胚胎發(fā)育、腫瘤形成及自噬誘導中起著關鍵作用［3］。

抗凋亡蛋白Bcl－2具有可容納BH3結構域的疏水凹槽，當其與beclin1結合后形成Bcl－2－beclin 1－Vps34復合物，導致脂質激酶Vps34活性明顯降低，抑制beclin 1介導自噬的功能［4］。Bcl－2和beclin 1的相互作用可以通過兩個不同機制進行調節(jié)(圖1):(1)含有BH3結構域的蛋白或BH3模擬物可同beclin 1競爭結合Bcl－2蛋白的BH3連接凹槽，從而解除Bcl－2對beclin1的抑制而誘導自噬。BH3模擬物ABT737能競爭性占據(jù)Bcl－2的BH3疏水連接凹槽，抵消Bcl－2對beclin 1的抑制作用。該過程與常態(tài)低水平自噬向高水平轉化密切相關，并拮抗了ABT737的抗凋亡活性。下調人類HeLa細胞或小鼠胚胎纖維母細胞的bad基因表達，饑餓誘導該類細胞發(fā)生自噬的程度明顯降低，予以ABT737后可得到恢復。(2)在營養(yǎng)缺乏和氧化應激等刺激下，原癌基因c－Jun氨基末端激酶1(JNK1)可通過使Bcl－2的非結構環(huán)內T69、S70、S87 3個位點磷酸化來破壞其與beclin 1的結合能力，促進自噬的發(fā)生［5］。在小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)敲除jnk1基因后，饑餓刺激不能使Bcl－2蛋白以上位點磷酸化、下調Bcl－2和beclin 1的親和力;Bcl－2蛋白的磷酸化突變體(T69E/S70E/S87E)亦不能與beclin 1蛋白相互作用，喪失對細胞自噬的抑制功能。

圖1 Bcl-2與beclin1相互作用參與細胞自噬的調節(jié)機制

上述兩個不同調節(jié)機制之間可能存在功能性的聯(lián)系:磷酸化Bcl－2蛋白減少了其對Bax以及其他BH3－only蛋白如Bid的親和力，而非磷酸化的Bcl－2突變體(T69A/S70A/S87A)增強了其對3個不同的BH3－only蛋白(Bid、Bad和Bim)的親和力，顯示多位點磷酸化的Bcl－2蛋白可能降低與包括beclin 1蛋白在內的多種BH3結構域蛋白的親和力。另一個猜測是Bcl－2蛋白磷酸化作用可能改變蛋白構象，對含有BH3結構域蛋白的選擇發(fā)生特異性改變，干擾了其與beclin 1的相互作用。另外，Bcl－2通過與beclin1相互作用調控自噬主要發(fā)生在內質網。當存在于內質網膜上的三磷酸肌醇受體(IP3R)被阻斷后可強烈誘導自噬。最近發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)剝奪性自噬因子 －1(nutrient－deprivation autophagy factor－1，NAF－1)可將Bcl－2與IP3R連接，從而將其靶定于內質網，推測IP3R復合體可能是Bcl－2與beclin 1在內質網上相互作用的橋梁［6，7］。

三、Bcl-2蛋白與細胞凋亡

Bcl－2家族是參與凋亡調控的關鍵分子，抗凋亡和促凋亡蛋白相互作用，共同調節(jié)線粒體結構和功能的穩(wěn)定性。Bcl－2抗凋亡蛋白通過BH3結構域與同族的促凋亡蛋白形成異源二聚體，維持蛋白在細胞內的穩(wěn)定分布。在凋亡相關信號刺激后，促凋亡蛋白受到一系列調節(jié)，如Bax構象變化，Bid和Bim裂解效應，Bad、Bik的磷酸化調節(jié)等，促凋亡成員向線粒體外膜靶向異位，導致線粒體通透轉換孔的開放，釋放促凋亡因子，激活caspase，執(zhí)行細胞凋亡。

最近研究發(fā)現(xiàn)，免疫細胞中的Bcl－2蛋白抗凋亡功能與熱休克蛋白家族成員Hsp90β有密切聯(lián)系，這可能依賴于熱休克蛋白的“分子伴侶”功能，對凋亡進行調控。用人未甲基化寡聚脫氧核苷酸(CpGODN)處理小鼠巨噬細胞株RAW264．7，可抑制熱休克蛋白Hsp90β對Bcl－2抗凋亡蛋白的影響，導致后者喪失抗凋亡活性，啟動線粒體凋亡途徑介導細胞死亡［8］。在大鼠嗜堿性白血病細胞株(RBL－2H3)和小鼠骨髓生成的肥大細胞的凋亡誘導研究中也發(fā)現(xiàn)了Hsp90β與Bcl－2蛋白抗凋亡效力的相關性。此外，抗凋亡蛋白在某些特定環(huán)境下對凋亡具有正性調控作用［9］。研究表明 Bcl－2蛋白環(huán)區(qū)的天冬氨酸(Asp34)是caspase－3的酶解位點，Bcl－2對凋亡的抑制受到caspase－3的調節(jié)，后者能夠在Asp34的位置切割Bcl－2蛋白，被裂解的Bcl－2向線粒體外膜轉移，通過BH3和跨膜結構域上調細胞凋亡。在HEK293T細胞株和人類外周血淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)，孤兒核受體Nur77/TR3出核定位于線粒體，綁定Bcl－2蛋白并使其構象發(fā)生變化，觸發(fā)線粒體死亡途徑，誘導凋亡［10］。最近一項研究發(fā)現(xiàn)，2－甲氧基－抗霉素A處理大鼠胰島素瘤細胞系β細胞(INS－1細胞)或鼠科TGF－α(轉化生長因子－α)轉染肝細胞株后，Bcl－2/Bcl－xl過表達的細胞具有較高的細胞毒性，其過表達可能提示預后較好［11］。

四、Bcl-2蛋白在凋亡和自噬中的串流

1．Bcl－2蛋白對Ca2+信號的調節(jié):Ca2+作為重要的第二信使，在細胞凋亡和自噬調控中都起到了十分重要的作用。鈣離子信號與Bcl－2家族蛋白相互作用調節(jié)亞細胞結構(包括細胞質、內質網和線粒體)中的鈣庫。Bcl－2家族對作用于線粒體Ca2+的調節(jié)表現(xiàn)在對線粒體通透性轉變孔(MPTP)的開放影響上。研究表明當MPTP開放時導致線粒體膜電位下降，Ca2+內流，這是啟動線粒體途徑細胞凋亡的直接原因。非磷酸化的Bad將線粒體表面存在的Bax同源二聚體單聚化，形成細胞色素C和Ca2+內流的交換通道。其中，Bcl－2蛋白和1，4，5三磷酸肌醇受體(IP3R)相互作用，直接抑制Ca2+從內質網釋放;Bcl－2蛋白亦可以降低內質網腔內鈣網蛋白(calreticulin)和鈣泵的表達來下調內質網內的Ca2+濃度［12］。Bcl－2家族抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白彼此結合、彼此抑制，協(xié)同決定凋亡的發(fā)生。

早期研究發(fā)現(xiàn)，用維生素D3及其類似物EB1089處理乳腺癌細胞株MCF－7影響細胞內游離Ca2+濃度，上調的Ca2+水平可激活自噬且這一過程與beclin 1基因的表達上調有關;進一步研究證實，Ca2+水平的增加，通過相繼活化鈣調蛋白依賴性激酶 β(CAMKK－β)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，抑制Akt－mTOR 通路，引發(fā)自噬［13］。然而，ER 定位的Bcl－2蛋白則可以改變ER膜系統(tǒng)滲透性或Bcl－2/xl形成類似白喉毒素和大腸桿菌的成孔結構域，形成離子傳導通道，使ER內的Ca2+直接釋放到胞質中，有效地遏制該信號通路［14］。由此可見，Ca2+是Bcl－2蛋白連接凋亡與自噬的一個重要信號分子。

2．Atg 5參與自噬和凋亡的轉換:參與自噬發(fā)生的蛋白主要由自噬相關基因(autophagy－related gene，atg)編碼，其中Atg5參與Atg12泛素樣蛋白加工修飾過程，形成Atg12－Atg5復合體，對于自噬體膜的形成和延展必不可少，并與Atg8/LC3的加工修飾過程相互影響。Atg5是自噬發(fā)生的重要調控位點之一，其表達可被TOR信號通路調控，從而影響自噬。此外，Atg5表達增高可令多種細胞，如乳腺腫瘤細胞，在各種刺激下更易具凋亡傾向。Atg5經過翻譯后修飾在凋亡中也起著關鍵作用［15］。

下調粒細胞集落刺激因子(GM－CSF)誘發(fā)人類中性粒細胞(PMN)凋亡，或以抗CD95的特異性單克隆抗體誘導T細胞Jurkat細胞株發(fā)生凋亡的過程中均可發(fā)現(xiàn) Atg5裂解物。24kDa的 truncated－Atg5(tAtg5)失去激活自噬的功能，靶向線粒體易位，釋放細胞色素C、活化caspase，具有促凋亡活性。實驗分析表明，tAtg5是由半胱氨酸蛋白酶家族成員calpain 1和calpain 2在Atg5的191－196位點直接裂解而成的(1～193)氨基酸產物。高水平表達的Bcl－2蛋白可保護細胞免受tAtg5表達增加而引起凋亡性細胞死亡。Atg5的191～196位點由半胱氨酸蛋白酶家族成員calpain 1和calpain 2直接裂解成24kDa的truncated－Atg5(tAtg5)失去參與自噬的功能，并向線粒體易位與Bcl－xL連接，置換Bcl－xL－Bax復合物，抑制Bcl－xL抗凋亡活性，活化Bax形成Bax－Bax同源二聚體，促進凋亡［16］。高水平表達的Bcl－2可保護細胞免受tAtg5增加而引起的凋亡。Atg5通過不同的結構形式參與了自噬和凋亡之間的轉換，并可與多種Bcl－2家族成員相互作用，其具體機制尚待進一步研究。

3．BH3結構域及其模擬化合物:BH3－only蛋白一方面通過其BH3結構域與Bcl－2結合，誘導自噬;另一方面直接或間接激活Bax/Bak樣促凋亡蛋白的活性，協(xié)同調節(jié)細胞凋亡。定位于內質網的beclin 1通過其BH3結構域與Bcl－2/Bcl－xL結合，使細胞內游離Beclin 1的濃度降低，進而下調Ⅲ型PI3K復合體活性，減弱自噬。Bad過表達可增加細胞內自噬相關微管相關輕鏈蛋白3(LC3)的點狀聚集，當Bad的BH3結構域被破壞，其誘導自噬的活性顯著降低。ABT－737是模擬BH3結構域的非肽類有機低分子，與抗凋亡蛋白Bcl－2，Bcl－xL和Bcl－w親和力較高。ABT－737能與beclin1競爭性結合Bcl－2/Bcl－xL，從而使 Bcl－2/Bcl－xL與 beclin1分離，引發(fā)自噬［17］。有趣的是，BH3－only蛋白成員(Bad，Noxa，t－Bid等)往往被認為具有促凋亡特性，但beclin 1蛋白是一個例外。研究顯示來源于beclin 1的含有BH3結構域的肽段具有凋亡誘導特性，然而，全長beclin 1過表達卻未能引起明顯的細胞凋亡。此外，與beclin 1相互作用的Bcl－2/Bcl－x，可能亦沒有喪失其抗凋亡特性［18］。自噬是不同環(huán)境中對刺激的適應性反應從而促使細胞存活或是潛在的凋亡誘因，還是導致細胞死亡的直接原因仍是近年來研究的重點。BH3－only蛋白被推測可通過線粒體在自噬和凋亡的轉換間起到的“開關”的角色:低強度的刺激信號下引起線粒體膜通透性(MMP)的改變后，BH3－only蛋白競爭性結合Bcl－2，增加游離beclin 1水平，激活自噬從而降解受損的線粒體;當刺激信號的強度達到一定水平時，BH3－only蛋白啟動線粒體途徑的細胞凋亡，同樣通過BH3結構域結合Bcl－2，拮抗后者抗凋亡作用，解除對Bax和Bad的抑制，介導MMP增加，釋放細胞色素C，驅使caspase活化行使凋亡功能［19］。

4．Bcl－2蛋白磷酸化功能:某些病理狀態(tài)下，如饑餓、生長因子剝奪、缺氧缺血損傷時，c－Jun氨基末端激酶1(JNK1)可介導Bcl－2蛋白BH3和BH4之間的非結構環(huán)多個位點磷酸化，這一過程可能參與細胞凋亡和自噬的調節(jié)。HeLa細胞在饑餓刺激下，Bcl－2磷酸化快速發(fā)生(約4h)，通過Bcl－2－Beclin 1復合體解離后誘導自噬，啟動可修復的細胞器損傷;隨著時間延長(16h)，自噬對細胞的自救行為不能再保證細胞存活，Bcl－2磷酸化轉而干擾Bcl－2－Bax復合體，激活caspase 3依賴性凋亡通路［5］。此外，最近的研究顯示，死亡相關蛋白激酶(DAP－kinase)也可介導beclin 1的BH3結構域某些位點磷酸化，通過削弱beclin 1和Bcl－2的結合能力上調自噬水平。Bcl－2蛋白磷酸化可能參與了凋亡和自噬的調控以及兩者機制之間的轉換［20］。

五、結 語

綜上所述，自噬和凋亡之間可能存在相互依賴和交叉作用，二者共同調控細胞的生存和死亡。Bcl－2是涉及自噬和凋亡相互影響、相互轉化中的重要蛋白;它可通過線粒體凋亡通路和beclin 1依賴性細胞自噬信號通路以及與不同通路中Bcl－2家族其他蛋白成員之間的相互作用和構象變化等方式對自噬和凋亡進行雙重調控。Bcl－2蛋白在自噬和凋亡中的串流作用可能與兩者間的相互影響，相互轉化密切相關，不同內、外環(huán)境影響以及不同組織和細胞中的相關信號通路的各種效應所產生的協(xié)同或拮抗作用有待進一步解釋和探討。隨著研究的不斷深入，Bcl－2蛋白及其家族成員在自噬或凋亡過程中如何發(fā)揮直接或間接的作用的具體作用機制，及其是否作為兩者潛在的交匯點等問題將取得突破性進展。Bcl－2蛋白與程序性細胞死亡機制的相關性可為疾病的發(fā)病機制和治療應用等相關研究領域提供新的思路。

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