禽畜養(yǎng)殖場土壤抗生素抗性基因污染的初步研究*

鄒世春，李 青 ，賀竹梅

(1. 中山大學(xué)海洋學(xué)院水產(chǎn)品安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510275；2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)品安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510275)

在醫(yī)療和養(yǎng)殖等過程中大劑量持續(xù)排放的抗生素選擇壓力下[1-2]，生物體不斷地接觸到低于致死濃度的抗生素[3]，這將引起細(xì)菌特定的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)[4-7]，固有抗性菌株和選擇性抗性突變株中的抗性基因(Antibiotic Resistance Genes, ARGs)便被選擇出來。當(dāng)這些抗性基因整合到基因移動元件能夠轉(zhuǎn)移并能在抗生素選擇壓力下能富集的時候，便被視為一種新型污染物而存在[8]，這將極大地危害人類健康及生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。四環(huán)素作為一種廣譜抗生素，憑借其殺菌作用顯著及較小副作用的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于人類及養(yǎng)殖業(yè)并進(jìn)入周邊環(huán)境，使得存在于環(huán)境微生物染色體上的四環(huán)素抗生基因tet被選擇出來，成為一種新型持久性的環(huán)境污染物。此外，大部分tet基因都能與基因移動單元(如能轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等)相連，使tet基因可在種間甚至屬間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，造成攜帶有tet基因的細(xì)菌容易在人體、動物、環(huán)境中廣泛存在，并通過基因水平轉(zhuǎn)移(Horizontal Gene Transfer，HGT)等方式，侵染到其他共生菌甚至病原菌中。而共生菌將作為tet基因以及其他ARGs的大型儲庫，造成對環(huán)境、人體健康的危害。對珠三角一些主要水體(河流、養(yǎng)殖基塘、污水處理廠及海灣等)中抗生素及北江河水中磺胺、四環(huán)素抗性基因污染的研究均表明，環(huán)境抗生素及其抗性基因污染已十分嚴(yán)重[9-11]。

本文以珠海某養(yǎng)殖場土壤及周邊基塘沉積物中的微生物及其ARGs為主要研究對象，使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及熒光實(shí)時定量PCR等技術(shù)，著重研究了多種四環(huán)素抗性基因的存在和污染水平，以期為我國養(yǎng)殖環(huán)境中抗性基因的污染狀況提供信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

所研究的養(yǎng)豬場為珠海高新區(qū)那州村四大豬場之一，年出欄數(shù)3000頭多左右，已使用20余年。養(yǎng)豬場周邊有人工種植林木和兩個養(yǎng)殖基塘，糞便經(jīng)化糞池簡單處理后通過溝渠排出，固體物用于林木施肥和魚塘。但由于管理問題，豬場對周邊河流、土壤及空氣造成一定污染，經(jīng)常受到周邊居民投訴。本研究選擇該養(yǎng)殖場土壤及周邊基塘沉積物，共設(shè)置了16個采樣點(diǎn)。采集養(yǎng)殖場0～5 cm 表層土壤樣品各約100～150 g，用無菌密實(shí)袋裝好，并記錄采樣時間、天氣、溫度等。

1.2 土壤樣品細(xì)菌耐藥性分析

取1 g土壤溶于10 mL無菌水中，移取100 μL均勻涂布在四環(huán)素終濃度為20 g/L的抗性LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有菌落生長。同時，將樣品涂布在不含有四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基上做陰性對照，初步分析樣品中四環(huán)素抗性菌群的大致狀況。

1.3 四環(huán)素類抗生素抗生基因(tet)分析

1.3.1 四環(huán)素類抗生素抗生基因的定性分析 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)對環(huán)境中拷貝數(shù)相對較低的ARGs進(jìn)行指數(shù)倍擴(kuò)增放大。首先采用OMEGA微量土壤DNA提取試劑盒法抽提土壤中總DNA，并采用NanoVue 超微量分光光度計(jì)測定其A260/A280及A260/A230比值。通常純DNA 的A260/A280值介于1.7～1.9之間。當(dāng)樣品中含有大量腐殖酸、蛋白、酚類等物質(zhì)時，會造成A260/A280值小于1.6；當(dāng)有RNA污染時，A260/A280值會大于1.9。不純凈的DNA樣品對后續(xù)的PCR反應(yīng)中的Taq酶等造成抑制作用，從而影響后續(xù)反應(yīng)進(jìn)行。

根據(jù)設(shè)計(jì)的引物[12-13](序列如表1所示)，對樣品中的9種tet基因及16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，相關(guān)反應(yīng)體系和程序如下。

表1 引物序列

PCR反應(yīng)體系：10×buffer，2.5 μL；引物，每反應(yīng)需要引物0.2 μmol/L；Taq酶，2.5 U/反應(yīng)；dNTPs，每種脫氧核苷酸為200 μmol/L；DNA模板，1.5 μL；ddH2O，19.3 μL；總體積為25 μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；然后95℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，共40個循環(huán)；接著72 ℃，10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，割膠回收、純化。將目的DNA(tetA、tetC、tetG和tetX)片段與pGM-T載體連接后，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中并提取白斑菌落的重組質(zhì)粒。經(jīng)過PCR驗(yàn)證后將質(zhì)粒上含有目的tet基因進(jìn)行測序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST功能對測序結(jié)果進(jìn)行分析，以進(jìn)一步驗(yàn)證所獲得ARGs(tetA、tetC、tetG和tetX)的核苷酸序列與基因庫中目的基因序列匹配的一致性，并為后續(xù)ARGs的定量分析做準(zhǔn)備。

1.3.2 四環(huán)素類抗生素抗生基因的定量分析 采用SYBR Green I熒光定量PCR法對樣品中tetA、tetC、tetG和tetX等4種四環(huán)素抗性基因進(jìn)行定量分析。qPCR體系為10 μL：2×SYBR supermix，1.5 μL；模板DNA，0.5 μL；引物，0.6 μL；ddH2O，8.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，預(yù)變性5 min；然后95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，共40個循環(huán)；最后72℃，10 min。將所提取的質(zhì)粒原液稀釋10倍成10個梯度(拷貝數(shù)從n×1010系列稀釋到n×101)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所計(jì)算出的目的基因濃度及樣品DNA的濃度，從而得出該目的基因在樣品DNA中的豐度。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤樣品耐藥性分析

根據(jù)細(xì)菌在抗性LB固體培養(yǎng)基生長狀況看來，16個采樣點(diǎn)土壤及沉積物樣品在四環(huán)素抗性培養(yǎng)基上都有細(xì)菌菌落生長，表明該地區(qū)四環(huán)素抗性細(xì)菌的存在十分普遍。并且，環(huán)境中只有5%左右的細(xì)菌能在抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，這意味著可能在環(huán)境中存在更多未能被培養(yǎng)的抗性細(xì)菌。因此，我們需要通過基因克隆、PCR和qPCR等分子生物學(xué)手段在基因水平上對抗性細(xì)菌及其抗性基因有更深入的研究。

2.2 四環(huán)素抗性基因(tet)存在水平分析

養(yǎng)殖土壤環(huán)境中tet基因PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，其樣品檢出率統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表2中。

圖1 9種四環(huán)素抗性基因(tetA、tetB、tetC、tetD、tetG、tetL、tetO、tetQ和tetX)的PCR擴(kuò)增電泳圖

根據(jù)圖1中9種四環(huán)素抗性基因(tetA、tetB、tetC、tetD、tetG、tetL、tetO、tetQ和tetX)的定性PCR電泳結(jié)果可知，除tetD未被檢出之外，其余8種均有檢出。從表2可以看出，在檢出的8種抗性基因中，除tetB檢出率相對較低(6%)之外，以tetG的檢出率為最高(94%)，其次為tetC和tetO(75%)，其他抗性基因的檢出率也較高(44%～69%)。

表2 抗生素抗性基因PCR結(jié)果統(tǒng)計(jì)

值得注意的是，在所檢出的8種四環(huán)素抗性基因中，tetA、tetB、tetC、tetD、tetG和tetL為用于編碼外排泵蛋白的基因。當(dāng)納摩爾濃度的四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞，與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏物不能與DNA操縱作基因結(jié)合，調(diào)節(jié)基因與結(jié)構(gòu)基因開始轉(zhuǎn)錄，編碼相應(yīng)的外排蛋白，將細(xì)菌體內(nèi)的藥物泵出，達(dá)到對抗生素的抗性。這些外排泵基因常與攜帶不同抗性基因甚至不同來源的質(zhì)粒相連，這無疑加劇了抗性基因在細(xì)菌群體中的轉(zhuǎn)移并使細(xì)菌易于產(chǎn)生多重耐藥。另外，tetO和tetQ主要為編碼核糖體保護(hù)蛋白，它們與核糖體結(jié)合后使核糖體構(gòu)象發(fā)生改變，從而使四環(huán)素不能與核糖體發(fā)生結(jié)合，從而起到對四環(huán)素的抗性。tetX是唯一編碼四環(huán)素滅活酶的基因，在有氧條件及NADPH作用下，該基因編碼的蛋白可以對四環(huán)素進(jìn)行修飾，使四環(huán)素失效。

上述結(jié)果表明，生長在禽畜養(yǎng)殖場土壤中抗四環(huán)素的細(xì)菌具有多種不同的抗性基因及其抗性機(jī)制，其中以編碼外排泵蛋白的基因占優(yōu)勢。這使得細(xì)菌可將進(jìn)入體內(nèi)的四環(huán)素重新泵至外環(huán)境，從而造成更大面積的四環(huán)素污染；另外，在四環(huán)素的低致死劑量的持續(xù)排放下，又會進(jìn)一步加劇tet基因的富集。

2.3 四環(huán)素抗性基因(tet)實(shí)時熒光定量結(jié)果分析

為了對樣品中常見的tetA、tetC、tetG和tetX等4種四環(huán)素抗性基因作進(jìn)一步的研究，我們對其進(jìn)行了實(shí)時熒光定量分析。本研究在前述PCR定性結(jié)果的基礎(chǔ)上，將樣品中所獲得的tetA、tetC、tetG和tetX等4種四環(huán)素抗性基因的測序結(jié)果與GeneBank中的目的序列比對發(fā)現(xiàn)，其吻合率在99%以上，進(jìn)一步確認(rèn)了樣品中存在tetA、tetC、tetG和tetX等4種抗性基因。

以成功獲得含有目的基因的質(zhì)粒制作qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過LightCycler?480熒光定量PCR系統(tǒng)所攜帶的樣品溶解曲線的設(shè)定程序來排除非特異性擴(kuò)增的干擾。

表3 tet-ARGs拷貝數(shù)與樣品DNA濃度的比值(copies/g DNA)

首先，采用含有目的基因的質(zhì)粒為樣品，獲得所對應(yīng)目的基因tetA、tetC、tetG和tetX的溶解溫度分別取84 ℃、84 ℃、84 ℃和78 ℃。選擇某一樣品對所設(shè)定的PCR反應(yīng)條件及溶解溫度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過觀察溶解曲線的單峰狀態(tài)，以確保該反應(yīng)條件不會出現(xiàn)基因的非特異性擴(kuò)增。tetA、tetC、tetG和tetX標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的起始濃度分別為336.5、26.5、587.0和111.0 ng/μL。將質(zhì)粒通過10倍系列稀釋后進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，可得到以CT為縱坐標(biāo)，以拷貝數(shù)及初始濃度相應(yīng)關(guān)系所得基因濃度為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2在1～0.997之間，滿足定量分析要求。通過測定ARGs的拷貝數(shù)與不同樣品所得DNA濃度的比值，可以代表ARGs在樣品細(xì)菌種群中總基因的含量比，亦即ARGs在環(huán)境中細(xì)菌總基因中的豐度，其結(jié)果列于表3中。從表3可知，4種tet-ARGs的豐度范圍在6.49×102～8.89×108之間，其中tetC在樣品中總體豐度最高(1.32×105～8.89×108)，其次分別為tetG(2.60×104～1.75×108)，tetA(1.57×102～5.75×105)和tetX(6.49×102～1.27×104)。在16個采樣點(diǎn)中，tetC和tetG copies/g DNA達(dá)到108數(shù)量級以上的均達(dá)到50%。表3中7、8和9號采樣點(diǎn)離養(yǎng)殖場污染源比較遠(yuǎn)(約300 m)，但該3個采樣點(diǎn)含量達(dá)到105數(shù)量級。除tetC之外，tetA和tetA在樣品中含量相對較低，但所有采樣點(diǎn)的copies/gDNA也處于102～105之間。

3 結(jié) 論

以珠海某養(yǎng)殖場土壤中細(xì)菌四環(huán)素抗性基因?yàn)橹饕芯繉ο?，采用DNA提取、基因克隆、定性PCR和熒光定量PCR等分子生物學(xué)方法研究了9種四環(huán)素抗性基因的存在及其污染水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所采集的16個土壤樣品中共檢出8種四環(huán)素抗性基因，樣品檢出率大多數(shù)在40%～94%之間；對其中常用的4種抗性基因的PCR定量分析結(jié)果表明，所有采樣點(diǎn)中tetC和tetG的copies/g DNA達(dá)到108數(shù)量級的占50%，其余采樣點(diǎn)tetC copies/g DNA含量也在102～105之間。與國內(nèi)外其他同類研究[14]，這種相對高的檢出率和高抗性基因水平表明目標(biāo)養(yǎng)殖場的抗性基因污染已十分嚴(yán)重，有必要進(jìn)行更加廣泛和深入的研究。

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