分子標(biāo)記技術(shù)在西花薊馬研究中的應(yīng)用進展

段惠生 張安盛 李麗莉 門興元 張思聰 周仙紅 于毅

摘要：西花薊馬是一種危險性較強的外來入侵害蟲，對我國的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟以及生物多樣性都造成了極大的損失和威脅。本文概述了分子標(biāo)記技術(shù)在西花薊馬的種類鑒定、種群分化、原產(chǎn)地、傳播模式、檢測其捕食天敵的效能和攜帶番茄斑萎病毒(TSWV)等方面的應(yīng)用，并做了前景展望。

關(guān)鍵詞：西花薊馬；分子標(biāo)記；種類鑒定；種群分化；傳播模式；TSWV

中圖分類號：S433.89文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942(2012)01-0099-05

西花薊馬(Frankliniella occidentalis)屬纓翅目(Thysanoptera)、薊馬科(Thripidae)，是一種世界性入侵害蟲。該蟲原產(chǎn)于美國西部地區(qū)，自20世紀80年代后，迅速向外擴散，2003年首次在北京發(fā)現(xiàn)，目前該蟲分布遍及全球各大洲。在我國。北京、云南、浙江、山東、貴州和江蘇等省市都已有分布和為害的相關(guān)報道。西花薊馬具有極端多食性，不僅本身對農(nóng)作物危害極大，并且還可以傳播番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)等多屬的植物病毒，造成更嚴重的損失。西花薊馬不僅對世界經(jīng)濟造成了極大損失，而且對入侵地的生物多樣性構(gòu)成了巨大的威脅，因此各國學(xué)者對其早已展開了多方面深入的研究。從20世紀80年代開始，由于分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，出現(xiàn)了多種多樣的分子標(biāo)記技術(shù)。分子遺傳標(biāo)記突破了表達型標(biāo)記的局限性，其變異只來源于基因DNA序列的差異，具有穩(wěn)定性高、受環(huán)境條件的影響較小、信息含量高、不同層次和類群之間廣泛可比等優(yōu)越性，因而成為遺傳標(biāo)記中又一強有力的工具，在揭示物種的遺傳變異性研究中發(fā)揮著獨特的優(yōu)勢。分子標(biāo)記的發(fā)展對西花薊馬的研究提供了強有力的技術(shù)支持。

分子標(biāo)記技術(shù)目前已出現(xiàn)了幾十種，新的分子標(biāo)記還會不斷涌現(xiàn)。昆蟲研究常用的一些分子標(biāo)記方法有，以Southern雜交為基礎(chǔ)的限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性(restriction fragmentlength polymorphism，RFLP)和DNA指紋譜；以PCR為基礎(chǔ)的隨機擴增片段長度多態(tài)性(randomamplified polymorphic DNA，RAPD)、DNA擴增指紋分析(DNA amplification fingerprinting，DAF)、重復(fù)序列引物擴增(simple repeat sequence primer-PCR，SRSP-PCR)、擴增片段長度多態(tài)性(ampli-fied fragmemt length polymorphism，AFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR(single-strand conformation poly-morphism-PCR，SSCP-PCR)；以重復(fù)序列為基礎(chǔ)的簡單重復(fù)序列即微衛(wèi)星DNA標(biāo)記(simplesequence repeat，SSR)；以mRNA為基礎(chǔ)的mRNA差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR(mRNA differential displayreverse transcription polymerase chain reaction，DDRT-PCR)、DNA測序(DNA sequencing)以及單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymor-phism，SNP)。本文概述了分子標(biāo)記技術(shù)在西花薊馬研究中的應(yīng)用情況，并對其應(yīng)用前景做了展望。

1.分子標(biāo)記在西花薊馬研究中的應(yīng)用

1.1西花薊馬分子鑒定的研究

西花薊馬是一種危險性較強的外來人侵害蟲，對于它的鑒定和分類工作顯得尤為重要。西花薊馬的成蟲在形態(tài)上具有明顯的特征，在顯微鏡下可以將其與其它近似種區(qū)別，但對于一些殘體、幼蟲以及無法從形態(tài)上辨別的蟲體，利用分子標(biāo)記技術(shù)可以準(zhǔn)確、快速地鑒定。國內(nèi)外學(xué)者在這方面已經(jīng)做了大量的工作。Moritz等(2000)采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribedspacer，ITS)——限制片段長度多態(tài)性(ITS-RFLP)的方法，成功地將西花薊馬和美棘薊馬(Echinothrips americanus Morgan)區(qū)分開；Toda和Komazaki(2002)采用ITS2-RFLP法鑒別日本果樹上常見的9種薊馬(包括西花薊馬)的成蟲和幼蟲；Brunner等(2002)根據(jù)mtCO I-433bp的擴增產(chǎn)物，結(jié)合測序和擴增產(chǎn)物RFLP分析，有效區(qū)分了西花薊馬、煙薊馬(Thrips tabaciLindeman)和棕櫚薊馬(Thrips palmi Karny)；林峻賢等(2003)則基于28S rDNA和16S rDNA探討Multiplex-PCR及PCR-RFLP鑒定西花薊馬和煙薊馬的可行性。采用PCR產(chǎn)物直接測序法，游中華等(2007)對包括西花薊馬在內(nèi)的9種薊馬的mtDNA CO I基因片段(433bp)進行了序列分析，準(zhǔn)確地檢測了各蟲態(tài)的西花薊馬。

在田間的防治和檢驗檢疫部門日常工作中時常會遇到有多種薊馬的樣本，這就需要用種特異PCR檢測(species-Specific PCR，SSP)。它是利用序列信息已知的DNA片段設(shè)計種特異引物進而鑒定薊馬種類。例如周力兵等(2007)利用Brunner等設(shè)計的簡并引物mtDNA-7.2F和mtDNA-9.2R擴增出了6種薊馬的mtDNA CO I基因片段，并且設(shè)計了西花薊馬特異性引物F.OL1/F.OR和F.OL2/F.OR，該兩對引物能夠?qū)⑽骰ㄋE馬的成蟲、幼蟲、蛹同花薊馬(Fran-kliniella intonsa)、黃胸薊馬(Thrips hawaiiensis)、八節(jié)黃薊馬(Thrips flavidulus)、煙薊馬(Thripstabaci Lindeman)和大薊馬(Megalurothrips distal-is)5種薊馬區(qū)分。游中華(2008)通過對西花薊馬近緣種的15種薊馬的ITS2序列分析對比，設(shè)計了一對西花薊馬特異性引物YW-ITS2-F和YW-ITS2-F，該引物可以準(zhǔn)確地將西花薊馬與其它十幾種薊馬區(qū)分。孟祥欽等(2010)采用特征序列擴增區(qū)域(SCAR)標(biāo)記技術(shù)獲得了對西花薊馬具有特異擴增效果的引物1對(FOMF/FOMR)，該對引物不僅對不同蟲態(tài)的西花薊馬具有擴增能力，而且在西花薊馬發(fā)生地的寄主植物組織內(nèi)亦檢測到了其卵的存在。

由此可見，mtDNA CO I和rDNA ITS2基因序列是國內(nèi)外學(xué)者常用于研究西花薊馬分子鑒定的兩種分子標(biāo)記，這兩種分子標(biāo)記都有一定的保守性，又具有適當(dāng)?shù)淖儺惗?，同時運用這兩種標(biāo)記的分子鑒定技術(shù)已經(jīng)十分成熟，操作簡單，鑒定速度快，而且準(zhǔn)確，因此得到廣泛的研究應(yīng)用。

1.2西花薊馬種群分化的研究

種群分化是指同一生物群體在不同的生存環(huán)境條件下，經(jīng)過長期的進化，彼此之間出現(xiàn)了形態(tài)

上、行為上和生理上甚至遺傳上不同程度的差異，這種差異或大或小，表現(xiàn)為彼此遺傳關(guān)系的遠近。種群的分化，在更多的情況下，是潛在的遺傳差異，為進一步的分化提供著遺傳多樣性的基礎(chǔ)。對于外來入侵害蟲種群，如若在入侵地產(chǎn)生明顯的種群分化，那么將有可能導(dǎo)致該入侵害蟲的大暴發(fā)。研究種群內(nèi)遺傳變異、種群間遺傳分化的過程及程度，對于理解物種的進化趨勢以及種群動態(tài)規(guī)律具有基礎(chǔ)性的意義，進而對入侵害蟲的治理起到重要指導(dǎo)作用。

目前，利用各種分子標(biāo)記技術(shù)來研究昆蟲種群遺傳分化已經(jīng)成為昆蟲生態(tài)學(xué)研究的熱點問題之一。武曉云等(2009)利用PCR技術(shù)克隆并分析了西花薊馬的rDNA ITS2和mtCO I基因5'末端的部分序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于rDNA ITS2變異程度較mtCO I基因大，因此mtCO I基因較rDNA ITS2更適合于西花薊馬的種內(nèi)遺傳分析；入侵我國的西花薊馬可能是由兩個(或多個)株系或隱存種組成的復(fù)合體，并推測入侵我國的西花薊馬以溫室系(greenhouse strain)為主體，也存在一定數(shù)量的羽扇豆系(lupin strain)。Brunner等(2010)利用mtCO I基因和微衛(wèi)星分子標(biāo)記(SSR)技術(shù)對美國西部地區(qū)西花薊馬種群進行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明在起源地西花薊馬種群發(fā)生了分化，發(fā)現(xiàn)這種遺傳分化與形態(tài)上的分化并不一致，并且討論了該地區(qū)的種群分化是由棲息地的環(huán)境不同(地理隔離)造成的。

用于該方面研究的分子標(biāo)記技術(shù)從先前的用mtCO I、rDNA ITS1、rDNA ITS2基因序列分析，到目前廣泛使用的SSR技術(shù)，兩種技術(shù)相互補充，能夠得到較為全面的結(jié)果。例如對我國的煙粉虱、美國白蛾以及蘋果綿蚜的研究。

1.3西花薊馬原產(chǎn)地及其傳播模式分析

西花薊馬原產(chǎn)于美國西部地區(qū)，后來隨著各國花卉業(yè)不斷發(fā)展，國際間貿(mào)易的頻繁逐步擴散到世界各國。2000年，在我國昆明國際花卉節(jié)參展的緬甸盆景上首次截獲西花薊馬。目前我國的多個省份已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了西花薊馬，對我國的經(jīng)濟造成了一定的損失，對我國本土的生物多樣性也產(chǎn)生了威脅。研究我國西花薊馬的原產(chǎn)地及其傳播模式，對于重新構(gòu)建西花薊馬的入侵過程，及時尋找并引進天敵，了解入侵初始種群大小及頻率，闡明生物在入侵過程中或入侵后的生物學(xué)變化，預(yù)測入侵物種的生物學(xué)特性以及借鑒有效的防治措施等具有重要的意義。

對于入侵種的原產(chǎn)地及其傳播模式的研究，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)無法做出準(zhǔn)確判斷，而利用先進的分子生物學(xué)技術(shù)，使這一入侵生態(tài)學(xué)問題得到有效地解決。將我國的西花薊馬種群與國外各地區(qū)的種群進行分子遺傳分化的對比分析，計算種群之間的遺傳距離，從而判斷親緣關(guān)系的遠近。這方面運用較多且研究較為成功的分子標(biāo)記技術(shù)是利用mtCO I基因和rDNA ITS2基因序列，例如，武曉云等(2009)采用mtCO I基因序列建樹分析云南、北京和哈爾濱的西花薊馬，推斷云南是西花薊馬最早入侵的地點，并且推測3個地區(qū)的西花薊馬可能是有相似的入侵來源。國內(nèi)也有成功運用mtCO I分析種群分化的例子，如褚棟等(2005)基于mtDNA CO I對我國煙粉虱種群與國外煙粉虱種群進行序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，我國廣大地區(qū)暴發(fā)成災(zāi)的煙粉虱為B型煙粉虱，與美國西部地區(qū)以及以色列的煙粉虱具有極高的同源性；首次發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱入侵我國，而發(fā)現(xiàn)的Q型煙粉虱與西班牙、摩洛哥的Q型煙粉虱有極高同源性。

目前對于西花薊馬種群遺傳分析，國內(nèi)外學(xué)者多采用，mtCO I和rDNA ITS2基因序列這兩種手段，但由于這兩種分子標(biāo)記相對保守，適合于分析遺傳分化較大的生物型或地理種群，對于研究更詳細的原產(chǎn)地分析則需要多態(tài)性更高的分子標(biāo)記，如SSR標(biāo)記。

1.4西花薊馬天敵的研究

目前西花薊馬僅在我國局部地區(qū)分布危害，而且由于其抗藥性強，利用本土天敵進行生物防治是一項有效的措施。目前，西花薊馬的捕食性天敵種類有30余種。國外利用且取得顯著成效的主要包括半翅目的蝽科和捕食螨。捕食性天敵對西花薊馬的控制效能是不一樣的，選擇出控制效能高的捕食陛天敵對于今后生物防治將起到關(guān)鍵性作用。

對于捕食者—獵物關(guān)系的研究，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法有多種，但卻有著部分捕食現(xiàn)象觀察難度大、室內(nèi)難以重建田間植被結(jié)構(gòu)和微環(huán)境、難以考慮多種因素的交互作用等局限性，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，這方面的研究技術(shù)也就從形態(tài)學(xué)水平發(fā)展到了分子水平。利用分子標(biāo)記技術(shù)能夠靈敏而特異地檢測捕食者體內(nèi)獵物殘體，從而準(zhǔn)確反映出捕食者對西花薊馬的捕食能力的大小。此方面研究應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)主要為兩類：一類是以蛋白質(zhì)為研究對象的血清學(xué)抗體技術(shù)，一類是以DNA為研究對象的分子標(biāo)記技術(shù)。前者常用的分子技術(shù)有聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測、多克隆抗體免疫檢測、酶聯(lián)免疫吸附法、單克隆抗體技術(shù)；，后者常用的有RAPD、RFLP、SCAR、微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)、DNA序列中的mtCO I、mtCOⅡ、rDNA ITS2以及實時熒光定量PCR技術(shù)。

實時熒光定量PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR的體系內(nèi)加入熒光染料或帶有熒光染料標(biāo)記的探針，熒光信號隨著目的DNA的擴增而增強，通過檢測信號判斷目的DNA的數(shù)量，進而鑒定標(biāo)本是否為靶標(biāo)種類，如棕櫚薊馬、煙薊馬等。孟祥欽(2010)選取mtCO I為標(biāo)靶DNA，利用TaqMan實時熒光定量PCR法檢測了9種西花薊馬的捕食性天敵，結(jié)果表明，捕食性天敵中東亞小花蝽的瞬時捕食能力最強，而異色瓢蟲的捕食能力最低，同時該實驗利用CO I和SCAR分子標(biāo)記技術(shù)建立了本地天敵對西花薊馬捕食作用的定性檢測技術(shù)。

分子標(biāo)記在此方面的研究也是有缺陷的，它不能區(qū)分捕食與腐食、二級捕食，因此形態(tài)學(xué)方法同分子生物學(xué)方法應(yīng)結(jié)合運用，發(fā)揮各自的優(yōu)點，從而使得西花薊馬天敵的研究能夠得到長足發(fā)展。

1.5西花薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒(TSWV)的檢測

番茄斑萎病毒((Tomato spotted wilt virus，TSWV)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)病毒，其傳播介體為薊馬。薊馬由若蟲在病株上取食獲毒，成蟲不能獲毒，但能夠?qū)Ｒ恍缘匾猿志眯缘姆绞絺鞑?，即薊馬一旦獲毒終身能夠傳毒。西花薊馬是番茄斑萎病毒最主要也是最有效的傳播介體。近年來，隨著西花薊馬的不斷擴散，番茄斑萎病毒也在全世界不斷地擴散傳播，造成世界農(nóng)業(yè)經(jīng)濟損失不斷加重。因此，各國學(xué)者逐步重視對西花薊馬攜帶的番茄斑萎病毒的研究。雖然西花薊馬是番茄斑萎病毒最主要的傳播介體，但并不是每個西花薊馬個體中都攜帶有番茄斑萎病毒，因此檢測某地區(qū)的西花薊馬體內(nèi)是否有番茄斑萎病毒顯得尤為關(guān)鍵。

檢測薊馬體內(nèi)的番茄斑萎病毒的方法有很多，像ELISA、電鏡觀察、核酸圓點印跡法以及免疫壓片印跡法。但這些方法在處理高通量的樣本時都存在不同的缺陷，電鏡觀察過于耗費時間，ELISA因為沒有結(jié)構(gòu)性蛋白而靈敏度較差，免疫壓片印跡法在問題的解釋上有一定的困難；除此之外，在ELISA和免疫壓片印跡法都會產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。

TaqMan實時熒光定量PCR(RT-PCR)是常用于檢測薊馬體內(nèi)病毒的分子標(biāo)記技術(shù)，它免去了PCR后續(xù)的檢測步驟，縮短了操作時間，顯著降低了PCR后操作污染的可能性，而且靈敏度更高，可以更加快速、高通量的檢測樣品，同時由于它是定量的，能夠檢測病毒與薊馬間的交互作用。Boonham以西花薊馬的核RNA為標(biāo)靶，初步探討了利用實時熒光RT-PCR探針檢測西花薊馬體內(nèi)是否攜帶番茄斑萎病毒的可能性，結(jié)果表明，這種方法不僅可以檢測單頭的個體，同時也適合應(yīng)用于大通量的樣品檢測。

2.小結(jié)與展望

從上述事例來看，目前分子標(biāo)記技術(shù)以其靈敏、快速、準(zhǔn)確的特點廣泛應(yīng)用在西花薊馬的研究中，極大地擴展了西花薊馬研究領(lǐng)域，豐富了研究手段。分子標(biāo)記技術(shù)種類繁多，而且每種技術(shù)本身都有優(yōu)缺點，因此在應(yīng)用的同時應(yīng)該綜合利弊，選取合適的標(biāo)記技術(shù)，以達到靈敏而準(zhǔn)確的目的，以免造成不必要的浪費。

西花薊馬是一種危險性外來入侵害蟲，它的入侵機制、傳播模式等人侵生態(tài)學(xué)問題是需要我們重點關(guān)注的。利用分子生物學(xué)技術(shù)來研究西花薊馬的生物適應(yīng)、競爭等成功入侵因素，成為未來我們研究西花薊馬的重點和難點，也是一個重要的突破口。國外對西花薊馬的研究起步早，研究范圍廣，但我國對西花薊馬的研究起步較晚，最早的報道始于2000年。為防止西花薊馬對我國經(jīng)濟造成的損失不斷加劇，我們在繼續(xù)深入地研究西花薊馬的同時，不斷地開發(fā)新的技術(shù)手段，從而更好地為將來的研究服務(wù)。煙粉虱也是一種世界性的入侵害蟲，對全球經(jīng)濟造成過重大損失，目前各國對其研究已經(jīng)十分深入而卓有成效，從其生物學(xué)特性研究到入侵生態(tài)學(xué)研究，分子標(biāo)記技術(shù)起到了關(guān)鍵性作用。對于西花薊馬的研究，筆者認為可以以煙粉虱研究為模板，結(jié)合西花薊馬本身特性以及相關(guān)的分子標(biāo)記，繼續(xù)深入展開研究。