關于“使用血球計數(shù)板對酵母菌進行計數(shù)”的問題探討

丁傅

摘要：“培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動態(tài)變化”是新課標教材“必修3：穩(wěn)態(tài)與環(huán)境”中的學生分組實驗，需要學生學會使用血球計數(shù)板進行準確計數(shù)酵母。通過結(jié)合“培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動態(tài)變化”這一實驗和有關血球計數(shù)板的命題的分析，對血球計數(shù)板的計數(shù)原理和操作方法中遇到一些問題進行探討。

關鍵詞：血球計數(shù)板 生物學實驗 實驗操作

中圖分類號：G633.91

文獻標識碼：B

在人教版高中生物教材中，“探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量變化”只作了基本的原則性指導，對一些操作過程的細節(jié)，沒有作細化闡述，而這些細節(jié)都是實驗成功的關鍵所在。

如何正確使用血球計數(shù)板對酵母菌種群數(shù)量進行計數(shù)，是本實驗的重點和難點。根據(jù)中學實驗條件，用顯微鏡直接計數(shù)法相對容易，只要指導學生掌握血球計數(shù)板的正確使用便可。但學生對血球計數(shù)板結(jié)構(gòu)的認識不夠明確，教師也講解不清晰。而在近年來的高考題或模擬題中多次出現(xiàn)相關的試題，而且不僅從如何計算酵母的數(shù)量的角度來考查學生，還從操作方法或操作過程中出現(xiàn)的一些問題以及處理方法來考查學生。而教師在遇到這些問題往往讓學生記答案，學生對這些問題仍是感到疑惑。筆者在近年來的教學實踐中，將教師和學生在做該實驗和相關命題遇到的一些問題，進行了分析探討。

1 血球計數(shù)板的構(gòu)造和計數(shù)原理

雖然不同版本的教材推薦使用的血球計數(shù)板的規(guī)格不同，人教版建議使用2mmx2mmx0.1mm方格，蘇教版推薦使用1mmx1mmx0.1mm方格，但是血球計數(shù)板的使用原理和方法是相同的。以下以1mmx1mmx0.1mm方格的計數(shù)板為例分析結(jié)構(gòu)和計數(shù)原理。

每個血球計數(shù)板上有兩個計數(shù)室（圖1）。血球計數(shù)板上的符號和數(shù)字（圖1）的含義是：XB-K-25為計數(shù)板的型號和規(guī)格，表示此計數(shù)板中計數(shù)室分25個中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計數(shù)室的高；1/400mm²表示計數(shù)室面積是1mm²（計數(shù)室邊長1mm），分400個小格，每小格面積是1/400mm²（圖2），9個大方格中只有中間的有小方格的中央大方格才是計數(shù)室。不要認為9個大方格都是計數(shù)室。

計數(shù)室通常也有兩種規(guī)格：一種是16x25型，即大方格內(nèi)分為16中格，每一中格又分為25小格（圖2）；另一種是25x16型，即大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同的特點，即每一大方格都是由16x25=25x16=400個小方格組成。

計數(shù)時，若計數(shù)室是由16個中方格組成，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個中方格（即100個小方格）的菌數(shù)。如果是由25個中方格組成的計數(shù)室，除數(shù)上述4個中方格外，還需數(shù)中央1個中方格（即80個小格方）的菌數(shù)（圖3）。計數(shù)時對壓在中格四條線上的細胞只計數(shù)相鄰兩邊及其夾角上的細胞（一般選左邊和上邊的線）。

以1minx1mmx0.1 mm方格的計數(shù)板為例，如果是25個中格的計數(shù)室，計數(shù)的5個中格菌數(shù)共N個，那么1mL培養(yǎng)液中菌數(shù)=N/5x25x10000x稀釋倍數(shù)。如果是16個中格的計數(shù)室，計數(shù)的4個中格菌數(shù)共N個，那么1mL培養(yǎng)液中菌數(shù)=N/4x16x10000x稀釋倍數(shù)。

2 血球計數(shù)板操作方法的注意事項

教師在介紹血球計數(shù)板的操作方法時，往往是比較簡略的。學生在操作中因為對操作要求不理解而造成操作不當，或者對操作中出現(xiàn)的異常問題的處理不知如何處理。而通過分析近幾年的有關血球計數(shù)板的相關試題，更注重操作方面的考查，而教師在這方面對學生分析闡述得少。

（1）在取樣計數(shù)前，為什么要將酵母菌培養(yǎng)液進行振蕩搖勻？

因為這樣使酵母菌分布均勻，防止酵母凝聚沉淀，提高計數(shù)的代表性和準確性，減小培養(yǎng)液中的酵母菌數(shù)量誤差。

（2）為什么要先在計數(shù)室上蓋上蓋玻片，再滴加菌液？

通常滴加菌液時，采用的是“滲入法”：先將蓋片蓋住計數(shù)室，蓋片的兩端應搭放在計數(shù)室兩側(cè)的支持柱上。從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴（不宜過多，一般將滴管口沿蓋片邊緣與計數(shù)平臺之間的空隙輕輕靠一靠即可），讓菌懸液滲入并充滿計數(shù)室，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去多余菌液。技巧：用吸水紙吸去多余的培養(yǎng)液時要迅速，保證計數(shù)室被培養(yǎng)液充滿，以減少誤差。

但也可采用“壓滴法”：先將適量菌液滴加在計數(shù)平臺上，再將蓋片從一側(cè)壓到計數(shù)扳上，使蓋片搭放在兩則支持柱上，將菌液滴壓平。不管用哪種方法，都必須把握3個原則：加入待測菌液后，計數(shù)室內(nèi)不能產(chǎn)生氣泡；不能將菌懸液沾到蓋玻片表面，以免污染顯微鏡的高倍鏡頭；不能將菌液沾到計數(shù)平臺兩側(cè)的支持柱表面。比較而言，滲入法更容易操作。

（3）如果先滴加菌液，再加蓋玻片，容易出現(xiàn)什么誤差？怎么處理？

如果先滴加菌液，再加蓋玻片（壓滴法），容易使菌液沾到計數(shù)平臺兩側(cè)的支持柱表面，在支持柱表面形成一層水膜而使蓋片不能完全落在支持柱上。蓋玻片由于液滴的表面張力作用而未能嚴密的蓋到計數(shù)板表面上，使計數(shù)室內(nèi)的體積增大，計數(shù)結(jié)果將偏高。應將血球計數(shù)板和蓋玻片洗凈、烘干重做。

（4）如果計數(shù)室中出現(xiàn)氣泡，會出現(xiàn)什么誤差？怎么處理？

如果計數(shù)室中出現(xiàn)氣泡，會使蓋玻片下有部分空間沒有充滿菌液，是待計數(shù)的菌液體積減少，導致結(jié)果偏小。應將血球計數(shù)板和蓋玻片洗凈、烘干重做。也就要重新制片。

為什么不采用在蓋玻片一側(cè)滴加菌液，另一側(cè)用吸水紙吸引的“引流法”？這是因為通過引流法，將蓋玻片下方的液體可以進行置換，可能會去除部分氣泡，但很難除盡氣泡。引出的菌液會帶走部分細胞，造成誤差。菌液也容易沾到蓋玻片表面，污染顯微鏡的高倍鏡頭而看不到目標。

（5）血球計數(shù)板應該如何正確清洗？

血球計數(shù)板使用結(jié)束后，應采用清水浸泡和沖洗的方式清洗，并進行烘干或自然晾干或用吹風機吹干。不能使用試管刷等硬物進行擦洗。鏡檢每個小格中是否存有污物、殘菌，如不清潔，需重新清洗直至潔凈。

這是因為血球計數(shù)板的方格線非常精細、脆弱，當用試管刷擦洗時會造成線條磨損。也不能用普通的餐巾紙等進行拭擦，可能磨損線條，也會在計數(shù)室中留下紙纖維等污物。要用專用的拭鏡紙輕輕擦拭。另外在使用血球計數(shù)板前需要在顯微鏡下檢查，不干凈要清洗烘干再使用。

（6）使用顯微鏡下進行計數(shù)，要注意哪些問題？

①血球計數(shù)板加樣后，需靜置片刻再使用顯微鏡計數(shù)。這是因為計數(shù)室中的菌懸液有一定的高度（0.1mm）。需要讓細胞沉降到計數(shù)室底部的網(wǎng)格線中，避免細胞分布在不同液層深度，導致計數(shù)時被遺漏。

②先在低倍鏡下，找到網(wǎng)格，也就是要先找到計數(shù)室（有小網(wǎng)格的部分）。將第一個計數(shù)中格移到視野中心，再換高倍鏡逐小格觀察并計數(shù)。觀察時還應安排一個順序，比如，依次按照左上中格、左下中格、右下中格、右上中格。若有第五中格時，當計數(shù)到右上中格時，先向左移動兩個中格，再往下移動兩個中格便是最中間的一個中格。小格的觀察順序最好是從左到右，從上到下逐格進行。計數(shù)時壓線的細胞本著計上不計下，計左不計右的原則，以免重復計數(shù)。

活酵母有芽殖現(xiàn)象，若芽體達到母細胞大小的一半時，即可作為兩個菌體計數(shù)；若芽體小于母細胞一半時為一個酵母細胞。

③因為生活酵母細胞的折光率和培養(yǎng)液的折光率相近，所以觀察時要減弱光照的強度，將視野調(diào)暗些。但不能太暗，否則也看不清。

④每個樣品計數(shù)應重復3次（每次數(shù)值不應相差過大，否則應重新操作），取其平均值。

（7）如果細胞數(shù)目過多，難以數(shù)清，應該采取什么措施？

如果一個小方格內(nèi)酵母菌過多，難以數(shù)清，應該進行稀釋，然后再進行計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5～10個菌體為宜。

稀釋時要注意：將1mL樣液稀釋10倍，不是加10mL無菌水，而是加9mL無菌水，即加水稀釋后的體積是原來的10倍。這點不仔細就很容易分析錯。例如將1mL樣液稀釋100倍，就應該加99mL水。而不是90mL水。

（8）能不能區(qū)分活酵母細胞和死酵母細胞，避免計數(shù)出現(xiàn)較大誤差？

探究“酵母菌種群數(shù)量變化”，理應為培養(yǎng)液中活菌體的數(shù)量變化，人教版教材中沒有提出活菌和死菌的分開計數(shù)問題。易理解成用總的菌體數(shù)作計數(shù)結(jié)果；蘇教版教材中雖建議用臺酚藍染液染色，但沒有說明這是對活菌（無色）和死菌（藍色）的區(qū)分，并且是將染液直接滴在血球計數(shù)板上，菌液濃度改變，造成誤差。正確的做法應是另外制作裝片，通過染色對活菌和死菌加以區(qū)分，算出兩者比例，進一步換算出總菌體數(shù)中的活菌數(shù)。由于臺酚藍染液配制相對復雜，且臺酚藍有一定致癌性，建議用呂氏堿性美藍（亞甲藍）染液對酵母菌染色，活的酵母細胞呈無色，死的或代謝衰弱的酵母細胞呈藍色。