蕎麥屬植物MAPK基因片段序列比較與進(jìn)化關(guān)系研究

梁成剛，陳晴晴，石桃雄，陳其皎，陳慶富

(貴州師范大學(xué) 植物遺傳育種研究所 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550001)

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蕎麥屬植物MAPK基因片段序列比較與進(jìn)化關(guān)系研究

梁成剛，陳晴晴，石桃雄，陳其皎，陳慶富*

(貴州師范大學(xué) 植物遺傳育種研究所 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550001)

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是植物MAPK級聯(lián)途徑中的重要信號分子。為了研究蕎麥屬M(fèi)APK基因序列變異以及種間進(jìn)化關(guān)系，對蕎麥屬8個(gè)野生種共25份材料的MAPK基因進(jìn)行特征引物PCR擴(kuò)增、測序和序列比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蕎麥屬植物種間MAPK基因PCR擴(kuò)增片段序列較為保守，8個(gè)野生種共25份材料中多態(tài)位點(diǎn)為125個(gè)，不變位點(diǎn)為680個(gè)。其中，12份野生苦蕎MAPK基因片段序列多態(tài)位點(diǎn)S僅為32個(gè)，說明蕎麥屬植物種內(nèi)MAPK基因序列高度保守。聚類分析發(fā)現(xiàn)野生甜蕎與左貢野蕎被聚為一類。野生苦蕎、毛野蕎、大野蕎、金蕎麥、細(xì)柄野蕎和硬枝萬年蕎被聚為一大類；其中，細(xì)柄野蕎和硬枝萬年蕎被聚在一起，其次與金蕎麥聚在一起；毛野蕎與大野蕎被聚在一起。研究結(jié)果可為蕎麥屬植物MAPK基因功能以及種間遺傳多樣性與進(jìn)化關(guān)系研究提供理論依據(jù)。

蕎麥；絲裂原活化蛋白激酶；基因片段序列；進(jìn)化關(guān)系

蕎麥(Buckwheat)是蓼科(Polygnaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)植物，起源于我國西南地區(qū)[1-3]。作為我國糧食作物中的一種小宗作物，蕎麥具有營養(yǎng)成分均衡，賴氨酸含量高等特性[4-6]。不僅如此，蕎麥還是藥食兼用作物，其富含黃酮類化合物，具有較高的藥用價(jià)值，尤其是蘆丁，具有降血脂、降血糖和降血壓的療效[3，7-8]。由于蕎麥生育期短，在歷史上長期被作為救災(zāi)糧食作物使用[3，6]。蕎麥主要種植在高寒地區(qū)，生育期內(nèi)常見干旱與凍害等自然災(zāi)害[1，9]。蕎麥表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐逆性，尤其是在抗寒、抗旱、抗病和耐貧瘠等方面[6]。

植物MAPK級聯(lián)通路是由MAPK、絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)和絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)組成的重要細(xì)胞信號傳遞途徑[10-11]。MAPK是絲氨酸/蘇氨酸(T)型蛋白激酶，由一個(gè)氨基酸連接蘇氨酸(T)和酪氨酸(Y)磷酸化位點(diǎn)形成典型的TXY三肽模塊，進(jìn)而被上游MAPKK激活[10-11]。生物界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在4類TXY結(jié)構(gòu)的MAPK，其中，哺乳動(dòng)物MAPK具有TGY和TPY結(jié)構(gòu)，真菌MAPK具有TPY結(jié)構(gòu)[12]，而植物中僅發(fā)現(xiàn)具有TEY區(qū)和TDY區(qū)的MAPK[11]。植物TEY類MAPK可分為A、B、C三組，TDY類MAPK則單獨(dú)為D組[11]。MAPK在植株生長發(fā)育過程中細(xì)胞分裂、分化及凋亡，激素代謝與逆境脅迫應(yīng)答等方面都具有重要調(diào)控作用[11，13-15]。例如，梁衛(wèi)紅等[16]研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsMAPK14含有典型的TDY結(jié)構(gòu)，非生物脅迫下水稻通過調(diào)節(jié)OsMAPK14基因表達(dá)緩解逆境對植株的影響。

形態(tài)學(xué)鑒定、核型分析、同工酶和蛋白亞基差異等方法在研究蕎麥屬植物遺傳進(jìn)化關(guān)系方面做出了重要貢獻(xiàn)。Chen[17]首先發(fā)現(xiàn)并命名了左貢野蕎，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)左貢野蕎與甜蕎較為相似。Yamane等[18]利用核型分析發(fā)現(xiàn)二倍體金蕎麥主要分布在云南、四川和西藏，而四倍體金蕎麥則僅分布在西藏；同工酶研究金蕎麥的起源與進(jìn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)云南和四川地區(qū)的二倍體金蕎麥被分別聚為一類；而四倍體金蕎麥存在兩次獨(dú)立的多倍化過程，一次在云南，另一次在西藏東部。張以忠等[19]利用酯酶同工酶研究蕎麥屬植物進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果分析甜蕎與大野蕎親緣較近，苦蕎與毛野蕎親緣較近。Li等[20]利用SDS-PAGE技術(shù)研究蕎麥屬植物蛋白亞基的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甜蕎及其野生類型野生甜蕎和變種F.esculentumvar.homotropicum、大野蕎與左貢野蕎被聚為一類；苦蕎及其野生類型野生苦蕎、毛野蕎、金蕎和巨蕎被聚為一類；細(xì)柄野蕎麥、F.pleioramosum和F.callianthum被聚為一類。蕎麥屬植物種間的關(guān)系較為復(fù)雜，其起源和進(jìn)化關(guān)系仍不十分清楚[21]。

植物進(jìn)化過程中，特定基因序列間的差異可作為研究物種親緣關(guān)系的依據(jù)。目前，有關(guān)蕎麥MAPK基因的研究尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組基因測序所得到的MAPKUnigene序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并根據(jù)其保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增蕎麥屬不同野生種的MAPK基因片段，通過序列差異分析，以期為蕎麥MAPK基因功能研究與起源進(jìn)化關(guān)系等研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用中國西南地區(qū)采集得到的25份野生蕎麥種質(zhì)為材料，由貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心提供。如表1所示，材料包括野生甜蕎、野生苦蕎、左貢野蕎、金蕎麥、細(xì)柄野蕎、硬枝萬年蕎、毛野蕎和大野蕎，共8個(gè)種。

1.2 基因序列的PCR擴(kuò)增及測序

使用改良的CTAB法提取嫩葉的DNA，操作的具體步驟參考陳晴晴等[22]方法。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序所得的數(shù)據(jù)(登錄號：SRS1350375)篩選獲得蕎麥MAPK的Unigene基因，利用Primer 5.0軟件在其保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。DNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系體積為60 μL，含有30.0 μL的2×TaqPCR MasterMix，9.0 μL 40 ng·μL-1的DNA模板，

表1 供試材料

Table 1 The materials used in this study

組別Group代號Code材料Material種名Speciesname收集地CollectingsiteWEWE1野生甜蕎1Wildcommonbuckwheat1F.esculentumssp.ancestralis四川SichuanWEWE2野生甜蕎2Wildcommonbuckwheat2F.esculentumssp.ancestralis云南YunnanWEWE3野生甜蕎3Wildcommonbuckwheat3F.esculentumssp.ancestralis西藏XizangWEWE4野生甜蕎4Wildcommonbuckwheat4F.esculentumssp.ancestralis—WTWT1野生苦蕎1Wildtartarybuckwheat1F.tataricumssp.potanini四川SichuanWTWT2野生苦蕎2Wildtartarybuckwheat2F.tataricumssp.potanini四川SichuanWTWT3野生苦蕎3Wildtartarybuckwheat3F.tataricumssp.potanini四川SichuanWTWT4野生苦蕎4Wildtartarybuckwheat4F.tataricumssp.potanini西藏XizangWTWT5野生苦蕎5Wildtartarybuckwheat5F.tataricumssp.potanini西藏XizangWTWT6野生苦蕎6Wildtartarybuckwheat6F.tataricumssp.potanini西藏XizangWTWT7野生苦蕎7Wildtartarybuckwheat7F.tataricumssp.potanini西藏XizangWTWT8野生苦蕎8Wildtartarybuckwheat8F.tataricumssp.potanini西藏XizangWTWT9野生苦蕎9Wildtartarybuckwheat9F.tataricumssp.potanini西藏XizangWTWT10野生苦蕎10Wildtartarybuckwheat10F.tataricumssp.potanini—WTWT11野生苦蕎11Wildtartarybuckwheat11F.tataricumssp.potanini—WTWT12野生苦蕎12Wildtartarybuckwheat12F.tataricumssp.potanini—ZZ1左貢野蕎1Zuogongwildbuckwheat1F.zuogongense西藏XizangZZ2左貢野蕎2Zuogongwildbuckwheat2F.zuogongense西藏XizangCC金蕎麥GoldenbuckwheatF.cymosum四川SichuanGG細(xì)柄野蕎FagopyrumgracilipesF.gracilipes貴州GuizhouUU硬枝萬年蕎FagopyrumurophyllumF.urophyllum云南YunnanPP1毛野蕎1Pilouswildbuckwheat1F.pilus西藏XizangPP2毛野蕎2Pilouswildbuckwheat2F.pilus西藏XizangPP3毛野蕎3Pilouswildbuckwheat3F.pilus西藏XizangMM大野蕎BigwildbuckwheatF.megaspartanium貴州Guizhou

“—”代表采集地不詳。

“—” represents the collecting site was unknown.

9.0 μL的ddH2O和6.0 μL 5 μmol·L-1的一對引物。反應(yīng)體系設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性60 s，55.6 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，反應(yīng)循環(huán)35次；再在72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3 測序結(jié)果分析與進(jìn)化樹的構(gòu)建

使用網(wǎng)頁(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上blastn進(jìn)行序列的在線比對。將序列對齊分值大于150，序列同一性大于65%的基因序列定義為高度同源。使用DNAsp5軟件進(jìn)行序列差異分析，使用MEGA5.05軟件進(jìn)行ClustalW多序列比對分析、遺傳距離分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥MAPK基因的PCR擴(kuò)增

對轉(zhuǎn)錄組基因測序(登錄號：SRS1350375)所得到的蕎麥Unigene進(jìn)行基因功能注釋和數(shù)據(jù)庫基因序列比對，獲得MAPK的Unigene序列。根據(jù)該Unigene基因保守序列設(shè)計(jì)特征引物，對25個(gè)供試材料進(jìn)行基因序列擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)在約900 bp處產(chǎn)生特異性條帶。從圖1可知，所有供試材料中所擴(kuò)增得到的條帶與目標(biāo)片段大小符合，初步判定擴(kuò)增所得到的序列是蕎麥MAPK基因片段序列。

M， Marker圖1 特異引物在25個(gè)材料中擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification products in 25 samples of buckwheat using specified primers

2.2 蕎麥MAPK基因片段序列的差異分析

將擴(kuò)增得到的DNA片段送由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序。將測序得到的WE1目標(biāo)片段基因序列進(jìn)行blastn比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陸地棉(Gossypiumhirsutum)MAPK1基因(登錄號：KM190106.1)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)MAPK基因(登錄號：AJ275316.1)和苜蓿MAPK-likeprotein基因(登錄號：XM_013589991.1)等序列對齊分值大于150，序列相似性高于80%，屬于高度同源。因此，認(rèn)為目標(biāo)片段為蕎麥MAPK基因。根據(jù)測序結(jié)果，對25份蕎麥野生材料MAPK基因片段序列中805個(gè)排列位點(diǎn)進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不變位點(diǎn)為680個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)S為125個(gè)，其中包含簡約信息位點(diǎn)數(shù)86個(gè)和單型可變位點(diǎn)39個(gè)。說明蕎麥屬植物種間MAPK基因序列差別較小。對其中12份野生苦蕎基因片段序列中867個(gè)排列位點(diǎn)進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不變位點(diǎn)為835個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)S為32個(gè)，其中包含簡約信息位點(diǎn)數(shù)6個(gè)和單型可變位點(diǎn)26個(gè)。說明蕎麥屬植物種內(nèi)MAPK基因序列高度保守。

2.3 基于MAPK基因片段序列差異的進(jìn)化關(guān)系

對蕎麥屬8個(gè)種25個(gè)野生材料MAPK基因片段序列進(jìn)行遺傳距離分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，種間平均遺傳距離為0.0325，種內(nèi)平均遺傳距離野生甜蕎為0.0145、野生苦蕎為0.0104、毛野蕎為0.0051、左貢野蕎為0.0105。從表2可知，野生甜蕎與大野蕎種間遺傳距離最大(0.0687)，硬枝萬年蕎與細(xì)柄野蕎種間遺傳距離最小(0.0000)。

利用植物MAPK基因序列種內(nèi)高度保守的特性，對8個(gè)野生種共25份野生材料進(jìn)行聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試的25份材料被聚為2個(gè)大的類群(圖2)。類群Ⅰ包括野生苦蕎、細(xì)柄野蕎、硬枝萬年蕎、毛野蕎和金蕎麥；類群Ⅱ包括野甜蕎和左貢野蕎。小粒組的硬枝萬年蕎與細(xì)柄野蕎被聚為一類，其次與金蕎麥被聚為一類，說明硬枝萬年蕎與細(xì)柄野蕎親緣關(guān)系較近，其次為金蕎麥；毛野蕎與大野蕎被聚在一起，說明其親緣關(guān)系近。左貢野蕎與野生甜蕎被聚為一類，說明其親緣關(guān)系近。

表2 基于MAPK基因片段序列的種間平均遺傳距離和種間平均凈遺傳距離

Table 2 The interspecific genetic distance and interspecific net genetic distance based onMAPKgene sequence

材料MaterialCGMPUWEWTZC0.00270.00950.00950.00270.06620.03040.0586G0.00270.00950.00950.00000.06260.03040.0586M0.00950.00950.00820.00950.06450.03180.0586P0.01130.01130.01000.00950.06100.03190.0559U0.00270.00000.00950.01130.06260.03040.0586WE0.06640.06680.06870.06700.06680.05030.0084WT0.03140.03140.03280.03470.03140.05550.0460Z0.05920.05920.05930.05830.05920.01330.0477

圖2 蕎麥不同系基于MAPK基因序列的聚類圖Fig.2 Dendrogram of buckwheat collections based on specific sites of MAPK gene fragment sequence

3 討論

蕎麥生長適應(yīng)性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的抗寒、抗旱、抗輻射和耐貧瘠能力，是一種重要的救災(zāi)糧食作物[6，23]。MAPK是植物重要信號分子，在逆境脅迫應(yīng)答方面具有重要的調(diào)控作用[11，13-15]。李鳳梅[24]研究發(fā)現(xiàn)，植物絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)基因序列高度保守。本研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥屬植物MAPK基因片段序列在種間較為保守，在種內(nèi)高度保守，8個(gè)野生種共25份材料中序列多態(tài)位點(diǎn)比例為15.5%，而12份野生苦蕎材料中序列多態(tài)位點(diǎn)比例僅為3.7%。因此，認(rèn)為蕎麥MAPK基因片段序列差異可作為研究蕎麥屬植物進(jìn)化關(guān)系的依據(jù)。

Zhou等[25]研究指出，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定結(jié)合可為研究蕎麥進(jìn)化關(guān)系提供更為可靠的依據(jù)。陳慶富研究發(fā)現(xiàn)左貢野蕎與甜蕎在形態(tài)學(xué)上較為相似[1，17]。本研究基于MAPK基因片段序列差異將左貢野蕎與野生甜蕎聚為一類，表明其親緣關(guān)系較近。陳慶富將大野蕎、毛野蕎、金蕎歸為金蕎復(fù)合物(F.cymosumcomplex)[1，17]。本研究發(fā)現(xiàn)，大野蕎和毛野蕎首先聚在一起，其次為金蕎麥，支持其歸為金蕎復(fù)合物一類[1，17]。通過同工酶研究，張以忠等[19]發(fā)現(xiàn)甜蕎與大野蕎親緣較近，苦蕎與毛野蕎親緣較近。Li等[20]研究指出，甜蕎、野生甜蕎、大野蕎與左貢野蕎被聚為一類；苦蕎、野生苦蕎、毛野蕎、金蕎和巨蕎被聚為一類。因此，陳慶富[1]推測大野蕎可能是甜蕎的祖先種，而毛野蕎可能是苦蕎的祖先種。本研究發(fā)現(xiàn)，野生甜蕎與左貢野蕎聚為一類，但與大野蕎較遠(yuǎn)；12個(gè)野生苦蕎被聚在一起，但與毛野蕎較遠(yuǎn)，其原因有待進(jìn)一步研究。

蕎麥屬植物中大粒組和小粒組的遺傳關(guān)系較為復(fù)雜，其中，硬枝野蕎的遺傳進(jìn)化關(guān)系還不十分清楚[21]。通過分子系統(tǒng)發(fā)育研究，鄭亞迪[26]發(fā)現(xiàn)硬枝野蕎的遺傳多樣性較為豐富，其確切的進(jìn)化關(guān)系有待進(jìn)一步研究。通過SSR分子標(biāo)記研究，史建強(qiáng)等[27]發(fā)現(xiàn)硬枝萬年蕎與細(xì)柄野蕎、齒翅野蕎、疏穗小野蕎和小野蕎歸為一類。本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)柄野蕎和硬枝萬年蕎的MAPK基因片段序列差異較小，其種間遺傳距離為0，經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化分析被聚在一起，表明其親緣較近。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Sequence analysis ofMAPKgene fragment and phylogenetic relationship of genusFagopyrum

LIANG Cheng-gang， CHEN Qing-qing， SHI Tao-xiong， CHEN Qi-jiao， CHEN Qing-fu*

(ResearchCenterofBuckwheatIndustryTechnology，InstituteofPlantGeneticsandBreeding，GuizhouNormalUniversity，Guiyang550001，China)

Mitogen-activated protein kinase is the major signaling molecule of MAPK cascade pathway in plants. To characterizeMAPKgene sequence mutations and phylogenetic relationship of genusFagopyrum， 25 collections of 8 wild species were selected for the PCR amplification， gene sequencing and analysis ofMAPKgene. The results indicated that theMAPKgene fragment sequence amplified by PCR was conservative since a total of 125 polymorphic (segregating) sites and 680 unchanged sites among 25 collections of 8 wild species of genusFagopyrumwere detected. Whereas only 32 polymorphic (segregating) sites were found among 12 collections ofF.tataricumssp.potaniniindicating thatMAPKgene sequence is highly conserved in intra-specie of genusFagopyrum. Hierarchical cluster analysis indicated thatF.esculentumssp.ancestraliswas clustered withF.zuogongense. By contrast，F(xiàn).tataricumssp.potanini，F(xiàn).pilus，F(xiàn).megaspartanium，F(xiàn).cymosum，F(xiàn).gracilipesandF.urophyllumwere clustered as a group.F.gracilipeswas clustered withF.urophyllum， and further clustered withF.cymosum. In addition，F(xiàn).piluswas clustered withF.megaspartanium. These results provide the theoretical basis for research ofMAPKgene， genetic diversity and evolutionary relationship of genusFagopyrum.

Fagopyrum; mitogen-activated protein kinase; gene fragment sequence; phylogeny

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.10.01

2016-01-15

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31471562，31171609)；國家燕麥?zhǔn)w麥現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金(CARS-08-A4)；貴州省科技廳合作計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合LH字[2015]7770號)；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)對象十百千計(jì)劃(2014GZ97588)

梁成剛(1985—)，男，重慶人，博士，助理研究員，從事作物栽培生理與分子機(jī)制等相關(guān)研究。E-mail: jesselcg@163.com

*通信作者，陳慶富，E-mail: cqf1966@163.com

S517；Q941+.2

A

1004-1524(2016)10-1631-06

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(10): 1631-1636

梁成剛，陳晴晴，石桃雄，等. 蕎麥屬植物MAPK基因片段序列比較與進(jìn)化關(guān)系研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(10)： 1631-1636.