禽致病性大腸埃希菌黏附素研究進展

魏寬翠，夏玉龍，馬興樹

（河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室，河北 邯鄲 056021）

禽致病性大腸埃希菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）又名禽致病性大腸桿菌，主要引起禽大腸桿菌病，以下呼吸道感染、氣囊炎、心包炎、肝周炎、腦膜炎和敗血癥為主要臨床特征[1]。自然條件下多與其他細菌、病毒混合感染，呈世界性流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一[2－3]。有資料表明，雞大腸桿菌病居雞細菌性疾病之首，占33%。我國每年因大腸桿菌病死亡雞3170萬多只，經(jīng)濟損失3億多元。禽致病性大腸埃希菌廣泛的致病性顯示了其基因組和毒力相關(guān)因子的多樣性，其毒力因子包括黏附素（adhesins）、毒素（toxins）、鐵獲得因子（iron acquisition factors）、脂多糖（lipopolysaccharides）、多聚糖莢膜（polysaccharide capsules）和侵襲素（invasins）等[4]。到目前為止，國內(nèi)外研究人員普遍認(rèn)為黏附素的黏附作用在細菌的致病機制中發(fā)揮著重要作用，是細菌在宿主上皮細胞定植的第一步[5]。禽源大腸埃希菌黏附素與人畜源大腸埃希菌黏附素既有相似之處，又有明顯差異，因此開展禽致病性大腸埃希菌菌毛黏附素特性研究，對揭示禽大腸桿菌病的發(fā)病機理及對該病進行免疫預(yù)防具有非常重要的意義。

1 黏附素

1.1 黏附素的成分及其作用

黏附素是具有黏附作用的各種細菌表面結(jié)構(gòu)的統(tǒng)稱，是細菌直接參與黏附的物質(zhì)。黏附是病原菌接觸和感染細胞的第一步，與致病性密切相關(guān)，它具有抵抗黏液沖刷、細胞纖毛運動清除等作用，有利于病原菌在宿主細胞的定植。禽致病性大腸埃希菌黏附素通常是細菌表面某種特定的糖脂成分或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可以是多糖或單糖、糖脂、糖蛋白、多肽、蛋白質(zhì)等，是一種具有多種結(jié)構(gòu)和功能的多樣化分子，可存在于細菌的細胞壁、外膜蛋白、鞭毛、菌毛及微毛（一種毛發(fā)樣突出物）等結(jié)構(gòu)中。黏附素的種類因菌種或菌株的不同而不同，或因同種不同菌株而不同，通常一種細菌只含1種黏附素，但有些細菌種或同種的個別菌株能同時表達2種或更多種黏附素[6]。Tatiana ADC等[7]的研究表明，不同臨床癥狀的大腸桿菌病伴隨不同黏附素基因的表達，即使一種癥狀也時常有幾種菌毛黏附素基因同時表達。例如敗血癥和腫頭綜合征在多數(shù)情況下就有2種～3種甚至4種黏附素DNA序列的表達。

1.2 黏附素黏附黏膜上皮細胞的過程

黏附素黏附黏膜上皮細胞的過程比較復(fù)雜，在不同細菌間差別較大，但一般可將整個過程分為 兩個階段。黏附的第一階段為聚集和吸附階段，是細菌在黏膜上皮細胞表面聚集，吸附并發(fā)生非特異性結(jié)合的過程，細菌靠靜電力、疏水力、分子運動等作用與上皮細胞表面接近。細菌與黏膜上皮細胞結(jié)合的過程在該階段是可逆的，可能會因為在液體中震蕩或沖洗而脫離，對去污劑也很敏感[8]。細菌黏附黏膜上皮細胞后可隨機進入黏附的第 二階段。黏附的第二階段為特異性黏附階段，是黏附素與上皮細胞受體發(fā)生特異性結(jié)合的過程，大腸埃希菌的菌毛頂部和周圍布滿了與受體結(jié)合的位點。黏附素松散地與受體結(jié)合后，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)肽引發(fā)宿主細胞的蛋白發(fā)生磷酸化。同時，細胞間Ca2＋濃度升高，并發(fā)生肌醇三磷酸化，使黏附素與受體以一種高度特異性的方式相互結(jié)合，該階段一般不會因在液體中震蕩或沖洗而脫離，對去污劑不敏感[8－9]。

2 黏附素的種類

目前，黏附素的分類依據(jù)還不統(tǒng)一，根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)，黏附素可以分成不同的種類。根據(jù)化學(xué)組成成分不同，黏附素可分為蛋白類黏附素和碳水化合物類黏附素；根據(jù)黏附素的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異，可將其分為菌毛黏附素（fimbriae或pilus）和非菌毛黏附素（afimbrial adhesin）；根據(jù)甘露糖血凝特性，可分為甘露糖抵抗血凝反應(yīng)（MRHA）黏附素和甘露糖敏感血凝反應(yīng)（MSHA）黏附素。人們往往根據(jù)其組成、形態(tài)、數(shù)目、分布、特性等的不同對其發(fā)現(xiàn)的新型黏附素進行命名。

通過對已知黏附素進行的研究，Tatiana ADC等[7]報道，APEC菌株中主要的黏附素分別是Ⅰ型菌毛、P菌毛、curli菌毛和溫度敏感型血細胞凝集素。以下是對Ⅰ型菌毛、P菌毛、curli菌毛和溫度敏感型血細胞凝集素的分述。

2.1 Ⅰ型菌毛黏附素

Ⅰ型菌毛結(jié)構(gòu)是在電子顯微鏡下觀察到的第一個細胞外非鞭毛絲狀附著物。大腸埃希菌Ⅰ型菌毛有凝集各種動物紅細胞，黏附多種組織表皮細胞，促進菌膜運動的能力，促使致病性大腸埃希菌與宿主上皮細胞受體的結(jié)合，但Ⅰ型菌毛的黏附作用受甘露糖抑制，即Ⅰ型菌毛為甘露糖敏感型菌毛[10]。

Naveh M W等[11]第一次報道Ⅰ型菌毛在禽致病性大腸埃希菌中的作用以及其對APEC感染的影響。該研究指出，在APEC感染中Ⅰ型菌毛黏附作用及其效果受發(fā)病雞的數(shù)量和疾病程度的影響。大腸埃希菌Ⅰ型菌毛主要在禽氣管、肺和氣囊中的上皮細胞表達，在其他組織或血液中則幾乎沒有表達。運用MSHA法進行檢測，Ⅰ型菌毛的檢出率為60%以上，PCR法的檢出率為80%以上。Tatiana ADC等[7]運用此兩種方法進行試驗發(fā)現(xiàn)Ⅰ型菌毛基因的檢出率不高，與他人的研究結(jié)果相反，因此其推測大腸埃希菌Ⅰ型菌毛的分布具有一定的地域性。

近些年來，隨著對Ⅰ型菌毛黏附素深入細致的研究，尤其是分子生物學(xué)等技術(shù)的運用，人們對Ⅰ型菌毛黏附素的認(rèn)識正逐步加深。Ⅰ型菌毛黏附素是菌毛亞單位蛋白聚合物，至少含有163個氨基酸，因其缺乏色氨酸和蛋氨酸，故具有疏水性。Ⅰ型菌毛的編碼基因位于染色體上，其合成涉及到fimA、fimB、fimC、fimD、fimE、fimF、fimG、fim I、和fimH共9個特定基因序列[12]，其中FimA菌毛蛋白是Ⅰ型菌毛的主要結(jié)構(gòu)蛋白。大腸埃希菌Ⅰ型菌毛的表達是階段性的，調(diào)節(jié)基因fimB和fimE控制Ⅰ型菌毛周期性的在有菌毛和無菌毛兩種形態(tài)之間進行轉(zhuǎn)變。FimD是菌毛在菌體上定位所必需的蛋白亞基，fimC則與FimA的生物合成有關(guān)。fimE，fimF，fimH與菌毛的黏附特性有關(guān)，且可能是Ⅰ型菌毛黏附素數(shù)量和長度的調(diào)控因子。fimH基因負責(zé)Ⅰ型菌毛甘露糖特性的表達和特殊黏附素受體的識別，而fimC是分子伴侶，直接負責(zé)Ⅰ型菌毛的組裝。分子進化動力學(xué)的研究表明，通過對Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因序列的強度選擇將會提高其與單一甘露糖和陰道上皮細胞的結(jié)合能力[13]。腦膜炎大腸埃希菌致病蛋白IbeA（invasion of brain endothelium A）具有調(diào)節(jié)fimH基因表達的作用，能夠使細菌穿過血腦屏障導(dǎo)致腦膜炎[14－15]。

在Ⅰ型菌毛純化試驗中發(fā)現(xiàn)這些受體結(jié)合蛋白在不同血清型之間具有一定的抗原保守性。此外，還有實驗證明各血清型菌株的Ⅰ型菌毛間存在一定的相同抗原位點且具有很高的同源性[16]。鑒于Ⅰ型菌毛基因結(jié)構(gòu)和碳水化合物構(gòu)型研究已基本清楚，用于抑制Ⅰ型菌毛與細菌黏附的低分子糖蛋白已經(jīng)合成，有望用于候選疫苗，預(yù)防大腸桿菌病[17]。

2.2 P菌毛黏附素

近年來，P菌毛在APEC中的重要性引起了廣泛的關(guān)注，在電鏡下觀察，P菌毛是由螺旋排列的亞單位蛋白組成的頭發(fā)樣附著物，類似于Ⅰ型菌毛，從而無法在形態(tài)學(xué)上區(qū)分P菌毛和Ⅰ型菌毛，但他們被識別和結(jié)合的受體不同。Ⅰ型菌毛受體主要是甘露糖單體或三聚體，而P菌毛受體則是P血清特異性抗原鞘糖脂（P－blood group antigen－specific glycosphingolipids），其主要是α－D－Galp－O－45β－D－Glap碳水化合物序列，P菌毛也是因此而得名。P菌毛因含有多變的結(jié)構(gòu)中心域而具有不同的血清型，但有研究發(fā)現(xiàn)，各血清型菌株P(guān)型菌毛基因結(jié)構(gòu)具有較高的同源性[18－19]。因含P菌毛的典型菌株是從尿道分離出來的，所以將編碼P菌毛的基因命名為pap基因或腎盂腎炎相關(guān)纖毛基因（pyelonephritisassociated pili genes）。

利用菌毛起源模型分析，從臨床分離出表達P菌毛的染色體，并證實染色體上pap基因簇包含了11個編碼P菌毛的基因組[20]。在編碼P菌毛的11個基因組中，papA基因是P菌毛單體的主要結(jié)構(gòu)基因，其編碼的PapA蛋白為右螺旋蛋白。通過免疫電子顯微鏡觀察到，PapA是P菌毛的主要成分，占菌毛質(zhì)量的99.9%。除PapA外，P菌毛還含少量的PapE、PapF以及PapG，其中后3種蛋白位于菌毛的尖端。PapF和PapG是黏附素的必要成分。PapG是特殊糖基黏附素，位于P菌毛絲狀纖維尖端，能夠介導(dǎo)P菌毛黏附素與Galα（1～4）Gal受體決定因子之間的結(jié)合或者使黏附素與腎細胞中的一系列球形糖脂相結(jié)合。PapG識別糖基化受體是觸發(fā)腎盂腎炎的前提條件。PapD分子伴侶產(chǎn)物與每一種菌毛蛋白亞單位相互作用形成有活力的復(fù)合物，是P菌毛生物合成中PapC外膜組裝蛋白的目標(biāo)復(fù)合物。PapH能終止PapA蛋白的聚合，使菌毛與細胞結(jié)合到一起。PapE形成一種叫做尖端絲狀纖維的開放式螺旋纖維。P菌毛通過PapG黏附素發(fā)揮黏附作用，PapG黏附素有3種分子變異型，分別是PapGⅠ ，PapGⅡ，PapGⅢ[21]。Lane M 等[22]研究不同動物獲得型尿路感染時發(fā)現(xiàn)，P菌毛的作用是可以改變的，特別是PapGⅡ。分子流行病學(xué)研究表明，PapGⅢ的等位基因通常是導(dǎo)致可變體發(fā)生的先決條件；同時，Pap GⅡ與菌血癥有關(guān)。Frendeus B等[23]的研究表明，P菌毛能夠利用通用類受體－4（TLR4）依賴性途徑觸發(fā)黏膜炎癥反應(yīng)。進一步研究表明，P菌毛有作為候選疫苗的潛能，并已有對P菌毛作疫苗進行免疫接種后相關(guān)結(jié)果的報道。

2.3 Curli菌毛黏附素

Curli菌毛被提議作為第三類大腸埃希菌表面附著物。Curli菌毛表面蜷曲結(jié)構(gòu)是由一種單一的結(jié)構(gòu)組成，能夠結(jié)合以下幾種血漿蛋白，如纖連蛋白、層黏連蛋白、血蛋白溶解酶原和組織纖溶酶原活化劑以及H激肽原。近來，研究者們已經(jīng)開始探索Curli菌毛在APEC感染中的作用，認(rèn)為血細胞凝集素，纖連蛋白及Curli菌毛在APEC菌株中共同表達是Curli菌毛致病的有力證據(jù)，同時還認(rèn)為血細胞凝集素和纖連蛋白是致病性大腸埃希菌黏附宿主表面細胞的重要毒力因子，與菌血癥細菌早期定植有關(guān)[24－25]。此外，Curli菌毛蛋白不同于所有已知的菌毛蛋白。研究發(fā)現(xiàn)從病雞中分離的大腸埃希菌99%都含有合成Curli菌毛的csgA基因，但因缺乏可識別的信號肽，所以只有部分宿主能夠組裝并表達Curli菌毛蛋白。

編碼Curli菌毛的基因位于csg（Curli菌毛蛋白亞單位基因）基因組中，由兩種不同的轉(zhuǎn)錄操縱子組成。一個轉(zhuǎn)錄操縱子編碼csgA，csgB和csgC，另一個編碼csgD，csgE和csgG，合成curli菌毛需要兩種操縱子同時表達。在大腸埃希菌中，Curli菌毛主要由csgA編碼，其編碼的蛋白Csg A大小為15 ku。Curli菌毛的組裝是Csg A蛋白細胞外的自組裝，且在組裝過程中需要依靠一種特殊核蛋白CsgB的協(xié)助。CsgD是Curli菌毛兩種操縱子表達所必須的轉(zhuǎn)錄活化劑，CsgG是維持CsgA和CsgB胞外穩(wěn)定的外膜脂蛋白。Curli菌毛編碼基因的表達較復(fù)雜，涉及幾種調(diào)節(jié)因子，如 H－NS（histone－like nucleoid structuring protein，組蛋白樣類核結(jié)構(gòu)蛋白）、RpoS（RNA polymerase Sigma S Subunit，又作σS，一種RNA聚合酶σ因子亞單位）、OmpR（outer membrane protein regulators，外膜蛋白調(diào)節(jié)子）以及 MIrA[MerR（mercury resistance regulator）－like regulator A][26－27]。在體外試驗中，Curli菌毛是細菌內(nèi)化造成禽敗血癥的必需物質(zhì)，其與P菌毛在禽敗血癥中的協(xié)同作用還需進一步研究。

2.4 溫度敏感型血細胞凝集素——Tsh黏附素

Provence D L等[28]首次在 APEC O78：K80菌株甘露糖血凝抑制試驗中發(fā)現(xiàn)，細菌在26℃培養(yǎng)時，血細胞凝集活性最強；37℃培養(yǎng)，凝集活性降低；42℃高溫時，則完全失活。他們把這種對溫度有強烈依賴性的凝集因子命名為溫度敏感型血細胞凝集素（temperature－sensitive haemagglutinin，Tsh），并確定其編碼基因為tsh。有試驗證明致病性大腸埃希菌比非致病性大腸埃希菌攜帶tsh基因的概率要高。研究發(fā)現(xiàn)禽致病性大腸埃希菌（E.coli）K－12菌株包含重組的tsh基因，能夠合成兩種蛋白，即106 ku的細胞外蛋白和33ku的外膜蛋白，可以凝集雞的紅細胞。近一步研究發(fā)現(xiàn)，Tsh剛合成時是一個大小為140ku的前體蛋白，在對其加工過程中產(chǎn)生了106ku的分泌蛋白和33ku的β管狀外膜蛋白[29]。純化的Tsh有黏附紅細胞，血紅蛋白，細胞外基質(zhì)蛋白，纖連蛋白和膠原蛋白Ⅳ的特性，與蛋白沉積有關(guān)，可加速細菌的定植速率。通過對Tsh陽性菌株的檢測，進一步證實Tsh與纖維蛋白沉積及氣囊損傷有關(guān)，且Tsh能提高大腸埃希菌在氣囊的定殖速率。同時還發(fā)現(xiàn)tsh基因與大腸埃希菌素Ⅴ（colicinⅤ）的基因發(fā)生連鎖，常常由同一個質(zhì)粒編碼表達。Claudie B等[30]也發(fā)現(xiàn)tsh和iss（increased serum survival protein）共同存在于同一個轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上，甚至將是否存在tsh和iss基因作為判定APEC的依 據(jù)。但 Dai J J等[31]也 證 實 在 APEC 的IMT5155菌株中Tsh的編碼基因位于染色體上，是一種自動轉(zhuǎn)運蛋白家族基因成員，與免疫球蛋白IgA有50%的相似性。溫度敏感型血細胞凝集素Tsh是一種新近發(fā)現(xiàn)的重要黏附素，其致病作用和編碼基因之間的相互作用還不清楚，有待科研工作者的進一步研究。

3 黏附素受體

3.1 糖蛋白或糖脂受體

多數(shù)禽致病性大腸埃希菌宿主細胞表面黏附素受體是糖蛋白或糖脂，大部分糖蛋白是由寡糖鏈通過N糖苷鍵與天冬氨酸相連或以O(shè)糖苷鍵與絲氨酸或蘇氨酸相連構(gòu)成，糖脂通常是一個親水寡糖鏈與疏水?；鶚?gòu)成的糖神經(jīng)鞘脂，而受體特異性部位往往就是其中的糖類殘基。如Ⅰ型菌毛的特異受體就是含D甘露糖殘基（D mannoside）的甘露糖單體和三體以及部分糖蛋白禽類呼吸道上皮細胞和部分內(nèi)臟基質(zhì)細胞。

3.2 細胞外基質(zhì)受體

部分黏附素的受體是機體內(nèi)細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的成分，如膠原蛋白、粘連蛋白、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)gn）等。

如P菌毛，P菌毛的受體是特異性P血清抗原鞘糖脂，P菌毛中的papE和papF兩個成分均可與粘連蛋白（fibronectin，F(xiàn)n）結(jié)合 。由于Curli菌毛其與細菌內(nèi)化和敗血癥有關(guān)，因此其受體就是血管中的各種血漿蛋白和基質(zhì)。Tsh黏附雞的紅細胞，所以其受體為雞的血紅蛋白，另外研究還發(fā)現(xiàn)，Tsh也黏附粘連蛋白和膠原蛋白Ⅳ。黏附素和受體分子的結(jié)合是在三級結(jié)構(gòu)上的配對，受體分子具有種屬和組織特異性，因而黏附素也具有種屬和組織特異性。

4 影響?zhàn)じ剿仞じ降囊蛩?/h2>

黏附素黏附細胞的過程較復(fù)雜，易受各種內(nèi)外環(huán)境因素的影響。主要影響因素如下：細菌的動力，細菌運動情況主要決定黏附素與受體間的接觸機會；局部分泌性抗體，如特異性抗菌毛抗體或其他黏附素分泌性抗體具有一定的阻斷作用，主要為sI－gA；黏附素受體類似物，細菌黏附素受體類似物可競爭性地與細胞表面的細菌黏附素受體結(jié)合，從而抑制黏附素的黏附作用；局部正常菌群，局部正常菌群具有抗黏附作用，其主要是通過局部正常菌群的空間占位作用及其所含有的黏附素類似物對細胞表面受體的封閉作用來完成；其他因素，如溫度、離子濃度等。培養(yǎng)溫度可影響細菌黏附素的表達，同時細菌發(fā)生黏附時的環(huán)境溫度也可通過對細菌動力等的影響而改變細菌的黏附率。細菌發(fā)生黏附時的離子濃度，特別是二價陽離子濃度對黏附結(jié)果有明顯的影響，其對細菌黏附的促進作用不但取決于電荷的多少，而且取決于離子的大小，一般認(rèn)為電荷可能在黏附素與其受體相互結(jié)合過程中起離子橋作用。

5 展望

有關(guān)禽致病性大腸埃希菌黏附素的研究從未間斷，但仍有很多未知或知之不多的領(lǐng)域，如黏附及黏附素產(chǎn)生機理、黏附素與細菌毒力關(guān)系、黏附素的檢測方法等等，有待進一步研究?？梢灶A(yù)料的是，從分子角度深入研究禽致病性大腸埃希菌黏附素的組成及致病機理，可以為闡明大腸埃希菌的致病機制，研發(fā)新型疫苗，控制和預(yù)防禽大腸桿菌病提供依據(jù)。但由于黏附素的種類繁多，致病機理復(fù)雜，要發(fā)展快速有效的診斷方法及制造安全有效的疫苗仍然任重道遠。

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