辛基酚對(duì)成年雄性小鼠血漿和脾臟抗氧化功能的影響

李 健，司麗芳，位志國，薛幫群，李 翔，位 蘭，李夢(mèng)云，陳樹林

（1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

隨著工業(yè)化的發(fā)展，環(huán)境雌激素的污染對(duì)人畜健康構(gòu)成極大的威脅，關(guān)系著人類的健康、生存與繁衍。辛基酚（octylphenols，OP）是一種具有較強(qiáng)雌激素活性的精細(xì)烷基酚類化合物，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)非離子表面活性劑、增塑劑、熱穩(wěn)定劑、石油添加劑等；存在于環(huán)境中的水體、淤泥、土壤、食物如魚類、貝類及飲用水中；還可生產(chǎn)油溶性酚醛樹脂、橡膠、硫化劑、印刷油墨、涂料以及配制防銹劑等[1－2]。研究發(fā)現(xiàn)OP具有雌、雄性生殖毒性、細(xì)胞毒性、致癌、發(fā)育毒性作用[3]，生殖損傷常伴隨抗氧化酶的活性異常[4－5]。在生理情況下，生物體內(nèi)產(chǎn)生的少量活性氧（ROS）和一氧化氮（NO），在細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、信號(hào)傳遞以及抗微生物防御和免疫監(jiān)視方面具有重要作用，但當(dāng)ROS和NO產(chǎn)生過多時(shí)，則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6－8]。脂質(zhì)過氧化物通過促進(jìn)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2＋釋放，激活鈣依賴的內(nèi)源性核酸酶，導(dǎo)致DNA斷裂、染色質(zhì)濃縮，引起細(xì)胞凋亡，線粒體產(chǎn)生的ROS又可以作用到線粒體，使細(xì)胞色素C釋放，激活caspase－9，引起細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[9]。多種因素能夠造成組織ROS增加，環(huán)境雌激素引起的ROS蓄積受到人們的廣泛關(guān)注。辛基酚對(duì)小鼠抗氧化功能的影響的相關(guān)報(bào)道很少。本試驗(yàn)通過采用辛基酚處理成年小鼠，研究體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的變化，探討辛基酚與ROS的關(guān)系，為闡明環(huán)境雌激素辛基酚的毒性作用機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

辛基酚（OP），Sigma產(chǎn)品。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）測(cè)試盒，總抗氧化能力（total antioxide capacity，TAOC）測(cè)定試劑盒，丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒，考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒等，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；20只成年雄性昆明小鼠，平均體重30g±2g，鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理 小鼠自由采食、飲水，每天14h光照，10h黑暗的條件下進(jìn)行飼喂。經(jīng)7d適應(yīng)飼養(yǎng)后。辛基酚處理：隨機(jī)分為4組，每組5只，分別灌胃0、1、10、100mg／kg辛基酚，對(duì)照組灌胃橄欖油50μL／只，每天1次，連續(xù)1周。

1.2.2 樣品測(cè)定 動(dòng)物處理結(jié)束后，將小鼠麻醉處死。采血，3500r／min離心10min，分離血漿，分裝，置－20℃保存。取脾在冷生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，放入小燒杯內(nèi)，盡快用眼科剪剪碎，加入9倍冷生理鹽水（先加2／3的量），倒入玻璃勻漿器中，用剩余1／3的生理鹽水沖洗燒杯，倒入勻漿器，上下研磨4min左右，使組織勻漿化。然后倒入離心管，3000r／min離心10min～15min，取上清分裝后于－20℃保存。

本試驗(yàn)分別測(cè)定血漿和脾組織中SOD、GSHPx、T－AOC、MDA、NO的含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 使用SPSS12軟件包進(jìn)行單因素方差分析，最小顯著極差法（LSD法），對(duì)差異顯著的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 血漿和脾組織中SOD含量

辛基酚顯著降低了血漿中SOD的水平，10、100 mg／kg組比對(duì)照組分別下降30.3%（P＜0.05）、55.6%（P＜0.01）（圖1A）。高劑量辛基酚組脾中SOD含量均顯著下降（P＜0.05），1、10、100mg／kg組比對(duì)照組分別下降16.4%（P＞0.05）、33.3%（P＜0.01）、31.5%差異極顯著（P＜0.05）（圖1B）。

2.2 血漿和脾組織中GSH－Px含量

辛基酚顯著降低了血漿中GSH－Px的水平，10、100mg／kg組比對(duì)照組分別下降17%（P＜0.01）、28.4%（P＜0.01）（圖2A）。10、100mg／kg劑量辛基酚組脾中GSH－Px含量均顯著下降26.4%（P＜0.05）、39.3%（P＜0.01）（圖2B）。

圖1 不同劑量辛基酚對(duì)小鼠血漿和脾組織中SOD含量的影響Fig.1 Effects of octylphenol on SOD content in plasma and spleen of mice

圖2 不同劑量辛基酚對(duì)小鼠血漿和脾組織中GSH－Px含量的影響Fig.2 Effects of octylphenol on GSH－Px content in plasma and spleen of mice

2.3 血漿和脾組織中T－AOC含量

10、100mg／kg辛基酚組顯著降低了血漿中TAOC的水平，比對(duì)照組分別下降29.3%（P＜0.01）、37.8%（P＜0.01）（圖3A）。不同劑量辛基酚組脾中 T－AOC含量均顯著下降，10、100mg／kg組比對(duì)照組分別下降39.9%、41.3%，差異均極顯著（P＜0.01）（圖3B）。

2.4 血漿和脾組織中MDA含量

辛基酚顯著升高了血漿中MDA的水平，10、100mg／kg組比對(duì)照組分別升高14.8%（P＞0.05）、40.7%（P＜0.01）（圖4A）。10、100mg／kg劑量辛基酚組脾中MDA含量也有一定的升高，比對(duì)照組分別升高46%（P＞0.05）、48.7%（P＜0.05）（圖4B）。

2.5 辛基酚對(duì)血漿和脾組織中NO含量的影響

如圖5所示，辛基酚顯著升高了血漿中NO的水平，10、100mg／kg組比對(duì)照組分別升高75%（P＜0.05）、82.1%（P＜0.05）（圖5A）。高劑量辛基酚組脾中NO含量均顯著升高，10、100mg／kg組比對(duì)照組分別升高118%、123%，差異均極顯著（P＜0.01）（圖5B）。

圖3 不同劑量辛基酚對(duì)小鼠血漿和脾組織中T－AOC含量的影響Fig.3 Effects of octylphenol on T－AOC content in plasma and spleen of mice

圖4 不同劑量辛基酚對(duì)小鼠血漿和脾組織中MDA含量的影響Fig.4 Effects of octylphenol on MDA content in plasma and spleen of mice

圖5 不同劑量辛基酚對(duì)小鼠血漿和脾組織中NO含量的影響Fig.5 Effects of octylphenol on NO content in plasma and spleen of mice

3 討論

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是體內(nèi)一類氧的單電子還原產(chǎn)物，與一些可以產(chǎn)生氧自由基的化合物如醌類化合物直接作用與細(xì)胞，打破細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞代謝平衡遭到徹底破壞，造成細(xì)胞壞死或凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致器官發(fā)育異常。有研究報(bào)道，不同濃度的活性氧對(duì)細(xì)胞的作用不同，納摩爾水平的ROS可促進(jìn)細(xì)胞增殖，微摩爾水平的ROS可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，毫摩爾水平的ROS引起細(xì)胞的損傷死亡[10]。王鮮忠等[11]利用 H2O2模擬細(xì)胞內(nèi)的 ROS環(huán)境，發(fā)現(xiàn)H2O2通過不依賴于微絲途徑和降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力使細(xì)胞內(nèi)ROS處于較高水平，并通過ERK級(jí)聯(lián)，使細(xì)胞中微絲發(fā)生多聚化，破壞微絲的結(jié)構(gòu)。清除ROS的抗氧化防御體系分為酶系和非酶系，如SOD、CAT、GPx、GSH－Px和維生素C和E、還原型谷胱甘肽（GSH）等[12]。Mishra D P等[13]證實(shí)，環(huán)境雌激素引起ROS大量增加，從而造成嚴(yán)重的生殖損傷。馬愛團(tuán)等[14]用乙烯雌酚處理倉鼠發(fā)現(xiàn)通過降低抗氧化酶SOD、GSH、GSH－Px活性，增加ROS含量，干擾生精細(xì)胞正常功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。多氯聯(lián)苯處理大鼠導(dǎo)致脾支持細(xì)胞的活性氧顯著增加，而抗氧化維生素E和C能夠增強(qiáng)抗氧化功能，減輕支持細(xì)胞的氧化損傷[15]。

辛基酚導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的明顯受損，隨劑量的增加而明顯降低抗氧化酶活性。血漿和脾NO含量顯著升高，SOD、GSH－Px抗氧化酶活性顯著下降。SOD是清除氧自由基最重要的酶之一，由于SOD的下降造成產(chǎn)生的過量ROS不能及時(shí)清除，從而損傷細(xì)胞的正常功能。辛基酚引起GSH－Px活性下降后，不能及時(shí)清除代謝產(chǎn)生的H2O2和脂質(zhì)過氧化物。T－AOC代表體內(nèi)酶類和非酶類抗氧化物的總體水平，是反映機(jī)體抗氧化作用的重要指標(biāo)。T－AOC明顯降低與抗氧化酶活性降低的結(jié)果相一致。MDA是細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸受到自由基攻擊后形成的一種脂質(zhì)過氧化物，MDA的含量常被用來反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而反映細(xì)胞損傷的程度。高濃度NO具有很強(qiáng)的氧化自由基特性，損害細(xì)胞膜脂質(zhì)，抑制呼吸鏈，造成組織的損傷。應(yīng)用辛基酚后，組織中MDA、NO含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。說明辛基酚導(dǎo)致血漿和脾組織氧化與抗氧化系統(tǒng)的破壞，產(chǎn)生大量ROS，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，升高M(jìn)DA和NO含量，造成氧化損傷。

[1]Vázquez G R，Meijide F J，Da Cua R H，et al.Exposure to waterborne 4－tert－octylphenol induces vitellogenin synthesis and disrupts testis morphology in the South American freshwater fish Cichlasoma dimerus（Teleostei，Perciformes）[J].Comp Biochem Physiol，2009，150（2）：298－306.

[2]Croteau M C，Davidson M，Duarte－Guterman P，et al.Assessment of thyroid system dismption in Rana pipiens tadpoles chronically exposed to UVB radiation and 4－tert－octylphenol[J].Aquatic Toxicol，2009，95（2）：81－92.

[3]洪燕燕，張育輝.辛基酚對(duì)中國林蛙蝌蚪生長發(fā)育的毒性效應(yīng)[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2010，5（3）：343－350。

[4]Ma A，Yang X，Wang Z，et al.Adult exposure to diethylstilbestrol induces spermatogenic cell apoptosis in vivo through increased oxidative stress in male hamster[J].Reprod Toxicol，2008，25 （3）：367－373.

[5]Li J，Wang Z X，Shi D Z，et al.Adult exposure to sasanguasaponin induces spermatogenic apoptosis in vivo through increased oxidative stress in male mice [J].Toxicol Industrial Health，2010，26（10）：691－700.

[6]李桂玲，孫小娜，張殿新，等.己烯雌酚對(duì)體外培養(yǎng)倉鼠生精細(xì)胞毒性作用的研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（5）：36－4.

[7]肖 鵬，高 洪，嚴(yán)玉霖，等.內(nèi)源性一氧化碳研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展.2009，30（5）：94－98.

[8]王 蕭，林傳權(quán)，許慶文，等.新西蘭兔心衰模型心肌損傷與一氧化氮的關(guān)系探討[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29（12）：5－10.

[9]Kim J Y，Park J H.ROS－dependent caspase－9activation in hypoxic cell death[J].FEBS Lett，2003，549（3）：94－98.

[10]Scherz－Shouval R，Elazar Z.ROS，mitochondria and the regulation of autophagy[J].Trends Cell Biol，2007，17（9）：422－427.

[11]王鮮忠，袁小麗，吳建云，等.活性氧對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞微絲的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，40（9）：1297－1302.

[12]Covarrubias L，Hernández－García D，Schnabel D，et al.Function of reactive oxygen species during animal development：Passive or active[J].Develop Biol，2008，320（1）：1－11.

[13]Mishra D P，Shaha C.Estrogen－induced spermatogenic cell apoptosis occurs via the mitochondrial pathway：role of superoxide and nitric oxide[J].J Biol Chem，2005，280 （7）：6181－6196.

[14]馬愛團(tuán)，陳耀星，王子旭.己烯雌酚對(duì)成年雄性金色中倉鼠的生殖毒性與氧化損傷的關(guān)系[J].動(dòng)物學(xué)報(bào)，2007，53（6）：1076－1082.

[15]Kumar J S，Banudevi S，Sharmila M，et al.Effects of vitamin C and E on PCB（Aroclor 1245）induced oxidative stress，androgen binding protein and lactate in rat Sertoli cells[J].Reprod Toxicol，2004，19（2）：201－208.