雞IFN－γ基因重組蛋白復(fù)性條件的優(yōu)化及生物活性鑒定

劉鼎闊，王立紅，徐大為，楊愛(ài)華，王建春，秦 操，張 勇＊

（1.鼎正動(dòng)物藥業(yè)（天津）有限公司，天津 300402；2.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300402；3.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，天津 300402；4.新鄉(xiāng)市紅旗區(qū)職業(yè)高級(jí)中學(xué)，河南 新鄉(xiāng) 453200）

IFN－γ屬于Ⅱ型干擾素，又稱免疫干擾素，是在特定誘生劑的作用下由多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有高度生物活性的可溶性糖蛋白，是一種重要的細(xì)胞因子[1]。IFN－γ在抵抗哺乳類和鳥(niǎo)類病原侵染中具有重要的作用，對(duì)腫瘤[2]、細(xì)菌[3]、病毒[4]以及寄生蟲(chóng)[5]等具有多重抵抗作用。目前研究已證實(shí)雞IFN－γ對(duì)流感病毒、新城疫病毒[6]、馬立克病病毒[7－9]及雞勞氏肉瘤病毒[10]等具有較好的抑制作用，它不僅參與機(jī)體對(duì)病原侵害的保護(hù)性應(yīng)答，還可通過(guò)細(xì)胞的信號(hào)通路廣泛參與包括調(diào)節(jié)機(jī)體主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ（MHCⅡ）成熟、抗原遞呈等在內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)，是機(jī)體內(nèi)重要的免疫增強(qiáng)劑[11]。

雞的IFN－γ基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，其開(kāi)放性閱讀框有495個(gè)堿基，編碼19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和145個(gè)氨基酸的成熟蛋白，其成熟蛋白大小約為18ku。本實(shí)驗(yàn)室從依莎褐雞中克隆獲得 的 cIFN－γ （GenBank accession number：AY705909），并成功的利用大腸埃希菌表達(dá)出具有生物活性的雞IFN－γ[12]。但由于雞IFN－γ在大腸埃希菌中表達(dá)效率過(guò)高，其表達(dá)產(chǎn)物主要以無(wú)活性的包涵體形式存在，須對(duì)包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性等后續(xù)處理工作，以獲得具有生物學(xué)效應(yīng)的重組表達(dá)產(chǎn)物。不同的重組蛋白的復(fù)性條件有非常大的差異，復(fù)性效率顯著不同，這些嚴(yán)重制約雞IFN－γ的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，我們對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性條件進(jìn)行優(yōu)化，力求找到一種簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、復(fù)性得率和效率較高的方法，為雞IFN－γ的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 重組雞γ干擾素（cIFN－γ）蛋白表達(dá)產(chǎn)物純化的重組雞γ干擾素由課題組制備[12]。

1.1.2 SPF雞胚 SPF雞胚購(gòu)于北京梅利亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，38℃孵化，控制濕度約60%。

1.1.3 雞新城疫病毒 （Newcastle disease virus，NDV） 新城疫病毒（CVCC，AV1611），購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，經(jīng)SPF雞胚尿囊接種，增殖一代，毒力為10－6CLD50／0.10mL。

1.2 方法

1.2.1 cIFN－γ復(fù)性條件的探索

1.2.1.1 利用緩沖液置換，以PBS進(jìn)行透析復(fù)性將純化得到的重組雞γ干擾素的濃度稀釋到100 μg／mL[13]，將其全部轉(zhuǎn)移入透析袋后，放在4℃預(yù)冷的透析液Ⅰ～Ⅲ （40mmol／L Tris－HCl，300 mmol／L NaCl，Urea濃度分別為6.0mol／L、4.5 mol／L和3.5mol／L，調(diào)pH8.0）中透析24h，每種透析液持續(xù)透析8h，每4h更換一次。轉(zhuǎn)移5mL至一新透析袋，放入透析液Ⅳ（PBS）中透析24h，間隔4h更換一次透析液，期間用磁力攪拌器溫和攪拌。復(fù)性完畢，取1mL樣品，4℃、10000r／min離心取上清液進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)定量和SDSPAGE電泳分析。

1.2.1.2 利用不同復(fù)性液進(jìn)行透析復(fù)性 參照1.

2.1.1 的方法，透析降低純化所得的重組雞γ干擾素中的變性劑濃度至3.5mol／L后，分別轉(zhuǎn)移至新透析袋至透析液Ⅳ（相應(yīng)的復(fù)性緩沖液，見(jiàn)表一）中透析復(fù)性24h。復(fù)性完畢，轉(zhuǎn)移至PBS中，透析除去殘留的變性劑。取最終復(fù)性完成的樣本1mL，4℃、10000r／min離心取上清液進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)定量和SDS－PAGE電泳分析。

表1 18種蛋白質(zhì)復(fù)性緩沖液配制表Tabel 1 Preparation of refolding buffer for 18proteins ／（mmol·L－1）

1.2.1.3 去污劑作用效果分析 將純化得到的重組雞γ干擾素的濃度稀釋到100μg／mL，分別將TritonX－100加入到透析液Ⅰ～Ⅲ處理前后的變性蛋白質(zhì)溶液中，4℃磁力攪拌器溫和攪動(dòng)4h，再參照1.2.1.2的方法在復(fù)性試液16中進(jìn)行復(fù)性及分析。

1.2.1.4 疏水劑作用效果分析 參照1.2.1.3，將經(jīng)透析液Ⅰ～Ⅲ處理后加入TritonX－100的重組雞γ干擾素所得的樣品平均分成五份，向第1、2份樣品中加入β－CD，溫和攪動(dòng)2h，將第1、3份樣品分別放在不添加PEG的復(fù)性試液16中進(jìn)行復(fù)性處理，將第2、4份樣品分別放在不添加任何疏水劑的復(fù)性試液16中進(jìn)行復(fù)性及分析，第5份樣本放在復(fù)性試液16中進(jìn)行復(fù)性。

1.2.2 重組雞γ干擾素復(fù)性產(chǎn)物的抗病毒活性分析

1.2.2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物的抗病毒活性 本次試驗(yàn)測(cè)定新城疫病毒（NDV）對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的毒力（TCID50）為10－6.123／0.1mL。取9日齡雞胚制備雞胚成纖維細(xì)胞[12]，待接種于96孔板的細(xì)胞生長(zhǎng)致密后，選用在復(fù)性試液3、8、11和16中復(fù)性完成的蛋白，分別在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入不同劑 量 （5、10、20、40、80 、160、320ng／mL）的cIFN－γ；同時(shí)選用1.2.1.3中復(fù)性的兩份蛋白、1.2.1.4中復(fù)性的第1、3、5份蛋白，分別設(shè)置1、5、10、20、40、80 、160ng／mL共7個(gè)試驗(yàn)組。待cIFN－γ處理細(xì)胞24h后，以100倍TCID50濃度，每孔20 μL的NDV感染細(xì)胞，設(shè)置空白對(duì)照組（無(wú)cIFN－γ和病毒）、陽(yáng)性對(duì)照組（40ng／mL cIFN－γ）、陰性對(duì)照組（10－6濃度NDV），每組各6個(gè)平行。病毒感染作用1h后，Hank′s緩沖液洗棄各孔病毒，加入1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72h，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并以MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。

1.2.2.2 雞胚試驗(yàn)分析cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物的抗病毒活性 本次試驗(yàn)測(cè)定新城疫病毒（NDV）對(duì)雞胚的毒力（EID50）為10－6.079／0.1mL。在進(jìn)行雞胚攻毒前，選用在復(fù)性試液8和16中復(fù)性完成的蛋白使雞胚建立抗病毒狀態(tài)，每種蛋白設(shè)立0.5、1、2、4、10 μg／枚5個(gè)蛋白組和1個(gè)空白對(duì)照組，每組10枚，共計(jì)12組。24h后接種100EID50的NDV，逐日觀察雞胚死亡情況至孵出。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物保護(hù)雞胚成纖維細(xì)胞及雞胚抗病毒活性進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)間差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 利用不同復(fù)性液對(duì)重組雞γ干擾素復(fù)性條件的摸索

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽是促進(jìn)cIFN－γ復(fù)性的關(guān)鍵因素，在蛋白得率排名前4的復(fù)性試液中均存在谷胱甘肽，最高得率為83.7%；而不含谷胱甘肽的復(fù)性試液最后的蛋白得率不超過(guò)40%（圖1）。

圖1 SDS－PAGE分析18種復(fù)性產(chǎn)物Fig.1 SDS－PAGE analysis of 18different refolding products

2.2 重組γ雞干擾素復(fù)性產(chǎn)物的抗病毒活性分析

2.2.1 cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）抗病毒活性的影響 顯微觀察結(jié)果顯示，病毒對(duì)照組的細(xì)胞大量變圓脫落，并伴隨細(xì)胞融合現(xiàn)象，其OD值在各組中均是最低（圖2，圖3）。

復(fù)性試液中同時(shí)引入疏水劑有助于cIFN－γ的復(fù)性，能有效提高其復(fù)興效率，數(shù)據(jù)顯示，樣本中添加疏水劑與否，在完整的16號(hào)復(fù)性試液中復(fù)性的產(chǎn)物的生物學(xué)活性均優(yōu)于不完整的（剔除PEG）復(fù)性試液16的復(fù)性產(chǎn)物（圖4）。

圖2 16號(hào)復(fù)性液復(fù)性產(chǎn)物對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞抗病毒活性的影響Fig.2 Effects of№16refloding liquid products on the antiviral activity of chick embryo fibroblast

圖3 4種復(fù)性試液中cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物對(duì)CEF抗病毒活性的影響Fig.3 Effects of cIFN gamma refolding products of four kinds of refolding solution on CEF antiviral activity

圖4 去污劑及疏水劑對(duì)cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物對(duì)CEF抗病毒活性的影響Fig.4 Effects of decontamination agent and a hydrophobic agent to cIFN gamma refolding products on CEF antiviral activity

2.2.2 cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物對(duì)雞胚抗病毒活性的影響以雞胚的存活率對(duì)攻毒后的存活時(shí)間作曲線，分析發(fā)現(xiàn)，攻毒后48h，兩組空白組的雞胚全部死亡，而在兩種復(fù)性試液中復(fù)性的不同濃度的（IFN－γ）均表現(xiàn)出一定的保護(hù)雞胚抵御NDV的能力。在復(fù)性試液8復(fù)性的蛋白組中，攻毒后72h給與0.5、1、2 μg蛋白組的雞胚存活率均降至50%以下，120h后2μg蛋白組的雞胚存活率僅為20%，其余兩組雞胚的死亡率為100%；4μg與10μg蛋白組在攻毒后72h的雞胚存活率均為80%，120h后仍均有60%的雞胚存活直至孵出。在復(fù)性試液16中復(fù)性的cIFN－γ表現(xiàn)出相對(duì)較高的防護(hù)能力，攻毒72h后僅0.5μg蛋白組的雞胚存活率降至10%，其余各蛋白組雞胚的存活率均在60%以上；120h后0.5μg蛋白組雞胚全部死亡，1μg和2μg蛋白組的雞胚存活率分別為10%和50%；4μg與10μg蛋白組雞胚的最終孵出率分別達(dá)到70%和90%（圖5）。

圖5 cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物對(duì)雞胚抗病毒活性的影響Fig.5 Effects of cIFN gamma renatured products on the chick embryo antiviral activity

3 討論

在大腸埃希菌中許多外源蛋白的高水平表達(dá)最后都會(huì)形成包涵體，包涵體具有無(wú)定形、呈非水溶性、只溶于尿素等變性劑和不具有相應(yīng)的生物學(xué)活性等缺點(diǎn)。想要進(jìn)行蛋白的相關(guān)功能研究和獲得具有生物學(xué)活性的蛋白必須對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性。透析除去變性劑是最常用和最廉價(jià)的蛋白復(fù)性方法，尤其適用于較大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，然而這種方法亦有其弊端，經(jīng)其復(fù)性后正確折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量不穩(wěn)定，有時(shí)會(huì)很降低，更有些蛋白尤其是含有多對(duì)二硫鍵的蛋白質(zhì)基本上不能正確進(jìn)行折疊。因此，探索一種能使雞γ干擾素穩(wěn)定高效復(fù)性的方法，是其當(dāng)前面向市場(chǎng)和進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。

本研究在獲得高效表達(dá)的cIFN－γ基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)其本身性質(zhì)、蛋白質(zhì)濃度、復(fù)性液的pH、變性劑的起始濃度和去除速度、助溶劑、疏水劑、離子強(qiáng)度、去污劑和氧化還原電勢(shì)等進(jìn)行了分析，并進(jìn)行了大量復(fù)性條件的摸索和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在cIFN－γ復(fù)性過(guò)程中，助溶劑、去污劑、疏水劑以及氧化還原電勢(shì)的效用最為顯著，其中助溶劑和疏水劑是保證復(fù)性得率的關(guān)鍵，而去污劑和氧化還原電勢(shì)直接關(guān)系到蛋白的復(fù)性效率。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)性前利用去污劑預(yù)先處理變性蛋白質(zhì)能顯著提升復(fù)性效率，復(fù)性效率與蛋白質(zhì)的純度呈正相關(guān)，在變性蛋白質(zhì)中引入去污劑，有利于進(jìn)一步除去蛋白中殘留的宿主菌成分，后續(xù)的活性試驗(yàn)證明，在相同的復(fù)性條件下，用去污劑預(yù)先處理的復(fù)性產(chǎn)物的有效濃度相對(duì)較低。在復(fù)性過(guò)程中，引入氧化還原電勢(shì)是雞γ干擾素成功復(fù)性的基礎(chǔ)，變性蛋白質(zhì)復(fù)性中常常存在二硫鍵搭配錯(cuò)誤的問(wèn)題，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集沉淀[14]，氧化還原對(duì)GSSG－GSH可以糾正搭配錯(cuò)誤的二硫鍵并催化其在正確位置上的形成，試驗(yàn)證明，8種不含有谷胱甘肽的復(fù)性試液復(fù)性的蛋白均不具有保護(hù)細(xì)胞抵御病毒的能力。

純化的重組雞γ干擾素經(jīng)18種不同的復(fù)性試液透析后，均得到不同程度的復(fù)性。其中復(fù)性試液3、8、11和16在透析復(fù)性的過(guò)程中，幾乎沒(méi)有產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的沉淀，其復(fù)性產(chǎn)物的得率最高，復(fù)性完成后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)定量分析發(fā)現(xiàn)，16后復(fù)性試液中復(fù)性的cIFN－γ得率可達(dá)83.7%。復(fù)性試液5、7、17和18中cIFN－γ的得率最低，在復(fù)性后期出現(xiàn)大量白色沉淀，其中18號(hào)復(fù)性試液組分相當(dāng)于生理鹽溶液，在其中復(fù)性的cIFN－γ幾乎全部沉淀析出。將復(fù)性試液中的不同成分及復(fù)性得率做logistic－regression分析表明，復(fù)性試液中助溶劑、去污劑、疏水劑以及谷胱甘肽的作用最為顯著。助溶劑在蛋白復(fù)性過(guò)程中可以通過(guò)破壞錯(cuò)誤折疊中間體的穩(wěn)定性，從而達(dá)到提高蛋白的可溶性的目的，L－精氨酸和蔗糖都是常用助溶劑，在本試驗(yàn)中，前者的助溶效果優(yōu)于后者。在cIFN－γ復(fù)性過(guò)程中去污劑TritonX－100的效用優(yōu)于Tween－20，在復(fù)性試液其他成分不變時(shí)，添加TritonX－100的蛋白得率為83.7%，明顯高于Tween－20的最高得率64.3%。選擇分別在復(fù)性開(kāi)始前后往變性蛋白質(zhì)溶液中加入去污劑，對(duì)蛋白的復(fù)性得率沒(méi)有顯著影響。疏水劑可以阻止蛋白質(zhì)分子間相互碰撞，減少蛋白質(zhì)的聚集沉淀，PEG與β－CD是最常用的蛋白質(zhì)修飾劑，本試驗(yàn)中兩者單獨(dú)使用的效用沒(méi)有顯著差異，兩者共用，協(xié)同作用顯著，擁有最高的蛋白得率。

選擇在變性的cIFN－γ中的變性劑濃度為8 mol／L和3.5mol／L左右時(shí)，向溶液中引入去污劑，對(duì)蛋白質(zhì)得率沒(méi)有顯著影響，但前者的復(fù)性產(chǎn)物的抗病毒活性優(yōu)于后者。復(fù)性試液組分中是否帶有疏水劑，能顯著影響復(fù)性產(chǎn)物的得率，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，變性的cIFN－γ中是否含有疏水劑對(duì)產(chǎn)物得率沒(méi)有顯著影響，但若復(fù)性試液中不含有疏水劑，80%以上的cIFN－γ將沉淀析出。

復(fù)性產(chǎn)物cIFN－γ對(duì)CEF細(xì)胞抗NDV保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在四種復(fù)性液中復(fù)性的40 ng／mL以上的cIFN－γ對(duì)侵入NDV的CEF均具有明顯的免疫保護(hù)作用（p＜0.05）；復(fù)性試液16中復(fù)性的蛋白在10ng／mL時(shí)便能保護(hù)CEF抵御病毒的入侵，隨著濃度的升高，其保護(hù)能力迅速提升，當(dāng)濃度達(dá)到160ng／mL時(shí)，其保護(hù)的CEF幾乎不受病毒侵襲；8號(hào)復(fù)性試液中復(fù)性的cIFN－γ的抗病毒活性相對(duì)較弱，當(dāng)濃度達(dá)到320ng／mL時(shí)，其保護(hù)作用仍未達(dá)到最優(yōu)。各陰性對(duì)照組中細(xì)胞的存活率和空白對(duì)照組相當(dāng)，說(shuō)明在離體狀態(tài)下各復(fù)性試液復(fù)性的蛋白對(duì)CEF細(xì)胞沒(méi)有毒害作用。

在考查去污劑及疏水劑對(duì)cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物保護(hù)雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）抗病毒活性的影響的試驗(yàn)中，所采用的5種cIFN－γ的復(fù)性方法對(duì)其產(chǎn)物高濃度下的生物學(xué)活性沒(méi)有顯著影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，變性蛋白樣品中引入去污劑TritonX－100的時(shí)間點(diǎn)能顯著影響蛋白的復(fù)性效率，選擇在復(fù)性開(kāi)始前用TritonX－100處理的復(fù)性產(chǎn)物的生物學(xué)活性在1 ng／mL時(shí)就具有對(duì)CEF的保護(hù)能力，其存活細(xì)胞的OD值顯著高于NDV對(duì)照組（P＜0.05），而選擇當(dāng)變性蛋白中變性劑濃度降到3.5mol／L左右再引入去污劑，該濃度下細(xì)胞存活率與NDV對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），當(dāng)?shù)鞍诐舛冗_(dá)到5ng／mL以上時(shí)，兩者保護(hù)的細(xì)胞的存活率均顯著高于各自的陰性對(duì)照組。在變性蛋白質(zhì)中引入疏水劑，能改善cIFN－γ的復(fù)性效率，結(jié)果顯示，在變性蛋白樣品中引入β－CD的復(fù)性產(chǎn)物，低濃度下對(duì)CEF的保護(hù)能力明顯優(yōu)于不添加疏水劑的復(fù)性產(chǎn)物。

透析復(fù)性是經(jīng)典的蛋白復(fù)性方法，具有批處理量大、操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)勢(shì)，易于考察影響復(fù)性效率的諸因素，可以方便得出較優(yōu)的復(fù)性條件。本研究通過(guò)對(duì)雞γ干擾素復(fù)性條件進(jìn)行優(yōu)化，成功找到了一種復(fù)性得率和復(fù)性效率均較高的復(fù)性方法，并通過(guò)雞胚成纖維細(xì)胞和雞胚試驗(yàn)驗(yàn)證其具有較高的生物學(xué)活性，證明了雞γ干擾素在病毒病的防治方面的廣闊的應(yīng)用前景，為新型抗病毒制劑的研制和干擾素的大批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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