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    無(wú)乳鏈球菌表面蛋白R(shí)ib 基因克隆與重組表達(dá)

    2012-06-29 09:00:52杜欣軍徐桂香
    關(guān)鍵詞:無(wú)乳鏈球菌克隆

    張 榮,杜欣軍,徐桂香,王 菲,王 碩

    (食品營(yíng)養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

    奶牛乳房炎是奶牛乳腺的炎癥反應(yīng),通常由微生物感染引起。在世界范圍內(nèi),奶牛乳房炎都是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)最重要的因素之一,并且難以控制[1]。乳房炎對(duì)于奶牛養(yǎng)殖業(yè)的危害包括產(chǎn)奶量下降、牛奶質(zhì)量降低和生產(chǎn)成本增高等[2]。奶牛乳房炎的預(yù)防和控制必須采取持之以恒的綜合性防治措施才有效,加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生是控制奶牛乳房炎的基本措施,而利用疫苗來(lái)控制奶牛乳房炎是防治本病的發(fā)展趨勢(shì)。

    導(dǎo)致奶牛乳房炎的病原微生物有細(xì)菌、真菌、病毒等,其中以細(xì)菌最為常見(jiàn)[3]。無(wú)乳鏈球菌是奶牛乳腺炎的病原菌,按Lance-field氏血清學(xué)分類(lèi),無(wú)乳鏈球菌劃歸B群。無(wú)乳鏈球菌為革蘭陽(yáng)性菌,菌體為圓形或卵圓形,直徑約0.6μm~1.2μm,無(wú)鞭毛,無(wú)芽胞,最適生長(zhǎng)溫度為36℃~37℃[4]。

    傳統(tǒng)的無(wú)乳鏈球菌莢膜多糖疫苗免疫原性較弱,使其應(yīng)用受到限制[5],而表面蛋白免疫原性較強(qiáng),是一種理想的候選疫苗。此外,表面蛋白作為微生物特征性的大分子,具有較高的種屬特異性,是一種理想的免疫檢測(cè)靶標(biāo)。因此,無(wú)乳鏈球菌表面蛋白的研究對(duì)于高效疫苗的研制與免疫檢測(cè)方法的建立具有重要的意義。

    Alp蛋白(α-like protein,Alp)是無(wú)乳鏈球菌重要的一類(lèi)表面蛋白,目前已鑒定出α、Rib、R28和Alp2等4種。其中Rib蛋白是從Ⅲ型菌株細(xì)胞壁提取物中分離出的一種高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)(123ku),其純化蛋白質(zhì)的特性與α蛋白有許多相似性,特別是這兩種純化蛋白質(zhì)的N端氨基酸順序有61%是相同的,但在免疫學(xué)性質(zhì)上無(wú)交叉反應(yīng)[6]。Rib蛋白質(zhì)對(duì)胰蛋白酶有耐受性,抗Rib抗體對(duì)Rib菌株所致的感染具有保護(hù)免疫作用[7]。Areschoug T等[8]的研究表明大多數(shù)Ⅲ型菌株和少量的Ⅱ型及Ⅴ型菌株亦能表達(dá)有Rib蛋白質(zhì)。大部分無(wú)乳鏈球菌具有Rib或α蛋白,而且已有研究顯示,如果用Rib和α蛋白一起免疫接種老鼠,不需用佐劑就可以對(duì)大部分無(wú)乳鏈球菌產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫保護(hù)作用,因此Rib與α聯(lián)合疫苗與其他疫苗相比有很大優(yōu)勢(shì)[9]。

    本研究成功克隆了Rib蛋白N端基因片段,并重組構(gòu)建了rib-pET26b表達(dá)載體,通過(guò)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以及誘導(dǎo)蛋白表達(dá)獲得了重組蛋白,并以此作為抗原免疫獲得了多克隆抗體,為無(wú)乳鏈球菌疫苗的開(kāi)發(fā)和免疫檢測(cè)方法的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    無(wú)乳鏈球菌ATCC BAA-1176(Ⅲ型)購(gòu)自ATCC公司;胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基(Tryptone soya broth)購(gòu)自O(shè)xiod公司;蛋白酶K、十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)、Tris、酚、氯仿、異戊醇(25∶24∶1)、瓊脂糖,均購(gòu)自BBI公司;GoTaq酶購(gòu)自Promega公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 基因組DNA的提取 將 ATCC BAA-1176菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,用基因組DNA提取試劑盒(Tiangen)提取其基因組DNA。

    1.2.2 Rib基因擴(kuò)增 以提取到的基因組DNA為模板,利用引物Rib F1(5′-AAGTTTGGTGCAGCTTCTGT-3′)和Rib R1 (5′-TTAGGATTATTATCAATATC-3′)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:94℃3min;94℃30s,45℃45s,72℃45 s,共進(jìn)行35次循環(huán);72℃10min。取5μL樣品進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并用凝膠回收試劑盒(Tiangen)進(jìn)行膠回收。

    1.2.3 目的基因的測(cè)序 將膠回收得到的目的基因與pEASY-T1載體連接并測(cè)序。

    1.2.4 表達(dá)片段的擴(kuò)增 根據(jù)測(cè)序結(jié)果,設(shè)計(jì)表達(dá)引 物 Rib F2(5′-TACTCAGAATTCGATTGGTATTAGTTTTTTAGG-3′,斜體部分為限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)EcoRⅠ)和 Rib R2(5′-TACTCACTCGAGCTCGTCCCATTTAGGGTCTT-3′,斜體部分為限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)XhoⅠ),以rib-pEASY-T1為模板進(jìn)行PCR,反應(yīng)條件為94℃3min;94℃30s,53℃45s,72℃45s,共進(jìn)行35次循環(huán);72℃10 min。將擴(kuò)增后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并進(jìn)行膠回收。

    1.2.5 rib-pET26b重組質(zhì)粒的構(gòu)建 過(guò)夜培養(yǎng)含有pET-26b的DH5α菌株培養(yǎng)過(guò)夜,提取pet26b質(zhì)粒,將此質(zhì)粒與PCR回收得到的Rib目的基因分別用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切,用DNA純化回收試劑盒分別回收后加入T4DNA連接酶連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽(yáng)性克隆。從陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒,利用載體引物T7 promoter和T7terminater對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定,利用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

    1.2.6 誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG 37℃誘導(dǎo)5h,SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)結(jié)果。

    1.2.7 Rib蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 由于37℃條件下表達(dá)蛋白不單一,因此在低溫條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并對(duì)IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化。分別選取0.1、0.05、0.01、0.005、0.001mmol/L的IPTG,在20℃條件下誘導(dǎo)12h。為了檢測(cè)蛋白是否形成了包涵體,離心收集菌體進(jìn)行超聲波破碎,利用SDS-PAGE對(duì)不同條件下的上清液和沉淀進(jìn)行檢測(cè)。

    1.2.8 包涵體變性復(fù)性及純化 首先利用緩沖液A(50mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,pH 8.0)和緩沖液 B(50mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,2mol/L脲,pH 8.0)分別對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行充分洗滌,然后使用緩沖液 C(0.1mol/L Tris-HCl,10mmol/L DTT,8mol/L脲,pH 8.0)將沉淀懸起,充分混勻,于37℃搖床快搖1h,離心將上清液置于50倍體積透析液(0.1mol/L Tris-HCl,5 mmol/L EDTA,5mmol/L Cysteins,pH 8.0)中透析2d。將透析袋中的復(fù)性蛋白取出離心,上清液與沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。用His-tag凝膠親和柱(Novagen)純化上清液,步驟按照操作手冊(cè)進(jìn)行,洗脫收集的蛋白用Bradford法測(cè)濃度,SDSPAGE檢測(cè)純化效果。

    1.2.9 質(zhì)譜鑒定 將SDS-PAGE凝膠上的目的蛋白條帶切成小塊,用乙腈及胰蛋白酶等處理,完成樣品制備,然后將樣品放入質(zhì)譜儀4700Proteomics Analyzer(ABI),用4000Series及GPS軟件進(jìn)行檢測(cè),選擇NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索蛋白。

    1.2.10 Rib多克隆抗體制備 將純化后Rib蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,切取目的蛋白后,利用液氮充分研磨,溶于9.0g/L NaCl;將0.5mg/mL的抗原1mL與弗式完全佐劑1mL乳化后初次免疫,對(duì)雄性新西蘭大白兔背部進(jìn)行多點(diǎn)皮內(nèi)注射;將0.25 mg/mL的抗原1mL與弗式不完全佐劑1mL乳化后加強(qiáng)免疫,分別于初次免疫后2、4、6周共加強(qiáng)免疫3次,于第3次免疫后7d,從耳緣靜脈處采血,利用間接ELISA方法[9]對(duì)抗血清效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。

    2 結(jié)果

    2.1 Rib蛋白基因克隆

    以基因組DNA為模板,用基因特異性引物擴(kuò)增目的基因,將此片段與T載體連接后進(jìn)行測(cè)序,經(jīng)BLAST比對(duì),與Rib蛋白基因同源性達(dá)到99%。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)表達(dá)引物,擴(kuò)增目的基因,電泳結(jié)果顯示,目的基因在480bp左右,與預(yù)期相符(圖1)。

    2.2 rib-pET26b重組質(zhì)粒的構(gòu)建

    將目的片段與pET26b分別酶切后進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)DH5α并篩選陽(yáng)性克隆。得到的陽(yáng)性克隆利用PCR和酶切對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果顯示重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

    圖1 rib基因片段的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of rib gene fragment

    圖2 PCR及酶切鑒定重組質(zhì)粒Fig.2 Recombinant plasmid verified by PCR and enzyme digestion

    2.3 誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE

    重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)(圖3)。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)后目的蛋白能夠大量表達(dá),但同時(shí)存在兩種形式的蛋白,根據(jù)蛋白大小,推測(cè)分子質(zhì)量較高的(約23ku)為目的基因與膜間隙定位信號(hào)融合蛋白,分子質(zhì)量較低的(約18ku)為膜間隙定位信號(hào)切除后的目的蛋白。

    2.4 重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化及蛋白形式鑒定

    對(duì)誘導(dǎo)后菌體進(jìn)行超聲波破碎,將上清和沉淀分別電泳,結(jié)果顯示在所有條件下,重組表達(dá)蛋白均形成包涵體。在低溫條件下,表達(dá)的蛋白僅為分子質(zhì)量較小的目標(biāo)蛋白。比較不同IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的差異,IPTG濃度為0.05mmol/L時(shí),目的蛋白的表達(dá)量最高(圖4)。

    2.5 Rib蛋白的純化與濃度測(cè)定

    對(duì)包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性,利用親和凝膠對(duì)復(fù)性后Rib重組表達(dá)蛋白進(jìn)行純化,結(jié)果顯示目的蛋白得到了較好的純化(圖5),蛋白濃度為0.480mg/mL。

    圖3 SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis of induced protein

    圖4 SDS-PAGE檢測(cè)包涵體Fig.4 SDS-PAGE analysis of inclusion bodies

    圖5 純化后以及復(fù)性后SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of renatured and purified protein

    2.6 重組蛋白的質(zhì)譜鑒定

    將純化后的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定(圖6),結(jié)果顯示該蛋白與無(wú)乳鏈球菌Rib蛋白的相似性達(dá)到99.99%,確定獲得的蛋白為正確的目的蛋白。

    2.7 多克隆抗體的制備

    利用間接ELISA測(cè)定多克隆抗體效價(jià),結(jié)果顯示多克隆抗體效價(jià)為1∶480000。

    3 討論

    本研究選擇了pET26b作為表達(dá)載體,該載體的多克隆位點(diǎn)上有一段融合表達(dá)標(biāo)簽(His-Tag),表達(dá)產(chǎn)物為His融合蛋白,方便后續(xù)的親和凝膠純化。此外,該載體還含有pelB信號(hào)肽序列,位于起始密碼和目的基因之間,可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜,使蛋白分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的周質(zhì)空間,減少形成包涵體的可能性。本試驗(yàn)在對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE時(shí)有2個(gè)蛋白條帶,我們推測(cè)分子質(zhì)量較大的蛋白正是由于融合了pelB而形成的。雖然使用pET26b載體進(jìn)行表達(dá)比較容易獲得可溶性蛋白,但本試驗(yàn)的蛋白仍然形成了包涵體,經(jīng)過(guò)變性復(fù)性才最終獲得可溶蛋白。以上結(jié)果顯示,pET26b表達(dá)載體并不適合可溶性Rib蛋白的表達(dá)。但是這并不妨礙這一蛋白作為疫苗或作為免疫檢測(cè)靶標(biāo)應(yīng)用于后續(xù)研究。

    圖6 Rib質(zhì)譜鑒定Fig.6 Rib identification by MS

    根據(jù)已有文獻(xiàn)[6]報(bào)道,對(duì)Rib蛋白的鑒定顯示它與α蛋白具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)及序列,它們都含有N端結(jié)構(gòu)域和重復(fù)序列,經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn),兩種蛋白這兩個(gè)區(qū)域的相似度分別達(dá)到61%和47%。因此通常把它們與另外兩種結(jié)構(gòu)相似的蛋白R(shí)28與Alp2同歸為Alp(α-like protein)蛋白家族,但是這兩種蛋白沒(méi)有交叉免疫性。而且α蛋白主要存在于Ia、Ib以及Ⅱ型菌株中,在Ⅲ型中不存在此蛋白,而Rib蛋白是在Ⅲ型菌株中發(fā)現(xiàn)的,而且大多數(shù)表達(dá)α蛋白的菌株都不表達(dá)Rib蛋白[10]??梢?jiàn),僅利用α蛋白作為疫苗雖然能夠?qū)Χ喾N血清型病原菌的感染產(chǎn)生免疫保護(hù)作用,但是仍然會(huì)遺漏部分菌株。因此,利用Alp蛋白作為疫苗應(yīng)該將多種表面蛋白混合使用。本研究獲得了Rib重組蛋白,為無(wú)乳鏈球菌全面保護(hù)性疫苗的開(kāi)發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

    Gravekamp C等[11]通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列會(huì)減弱整個(gè)蛋白的免疫反應(yīng),而且通過(guò)對(duì)Rib蛋白的結(jié)構(gòu)域分析 (http://smart.embl-h(huán)eidelberg.de)發(fā)現(xiàn)該蛋白N端結(jié)構(gòu)域包含跨膜區(qū),文獻(xiàn)[12]顯示該區(qū)域不僅與細(xì)菌的防御機(jī)制有關(guān),而且與細(xì)菌毒性(包括黏附,侵染甚至誘發(fā)感染性休克)密切相關(guān),根據(jù)這些研究推測(cè)N端結(jié)構(gòu)域在刺激宿主免疫系統(tǒng)方面發(fā)揮重要作用,是一段理想的候選疫苗與免疫檢測(cè)靶標(biāo)。因此,本研究選擇Rib的N端序列,一方面由于片段較短便于克隆、表達(dá),另一方面,能夠更好的保證蛋白的免疫原性。

    [1]Forsman P,Tilsala-Timisjarvil A,Alatossava A.Identification of staphylococcal and streptococcal causes of bovine mastitis using 16S-23SrRNA spacer regions[J].Microbiology,1997,143(11):3491-3500.

    [2]Riffon R,Sayasith K,Khalil H,et al.Development of a rapid and sensitive test for identification of major pathogens in bovine mastitis by PCR[J].J Clin Microbiol,2001,39(7):2584-2589.

    [3]張繼東,李淑芳,苑方重,等.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定和中藥防治試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2006,42(11):32-33.

    [4]金慧心,王 艷,張丹瑩.關(guān)于無(wú)乳鏈球菌感染的新進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)學(xué),1998(12):12.

    [5]岳麗琴,周育森,張庶民,等.B族鏈球菌C5a肽酶表位的預(yù)測(cè)、分段表達(dá)及其免疫原性[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2010,23(5):460-465.

    [6]Lindahl G,Stalhammar-Carlemalm M,Areschoug T.Surface proteins of Streptococcus agalactiae and related proteins in other bacterial pathogens[J].Clin Microbiol Revi,2005,18(1):102-127.

    [7]Stalhammar-Carlemalm M,Stenberg L,Lindahl G.Protein Rib:a novel group B streptococcal cell surface protein that confers protective immunity and is expressed by most strains causing invasive infections[J].J Exp Med,1993,177(6):1593-1603.

    [8]Areschoug T,Stalhammar-Carlemamm M,Larsson C,et al.Group B streptococcal surface proteins as targets for protective antibodies:identification of two novel proteins in strains of serotype V[J].Infect Immun,1999,67(12):6350-6357.

    [9]清華大學(xué).大腸桿菌菌體多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用:中國(guó),200610113827.9[P].2007-03-28.

    [10]Larsson C,Stalhammar-Carlemalm M,Lindahl G.Protection against experimental infection with group B Streptococcus by immunization with a bivalent protein vaccine[J].Vaccine,1999,17(5):454-458.

    [11]Gravekamp C,Kasper D L,Michel J L,et al.Immunogenicity and protective efficacy of the alpha C protein of group B streptococci are inversely related to the number of repeats[J].Infect.Immun,1997,65(12):5216-5221.

    [12]Li J,Kasper D L,Ausubel F M,et al.Inactivation of the a C protein antigen gene,bca,by a novel shuttle/suicide vector results in attenuation of virulence and immunity in group B Streptococcus [J].Proc Natl Acad Sci,1997,94(24):13251-13256.

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