電針的不同波形對實(shí)驗(yàn)性大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中HSP70表達(dá)的影響

金 弘，劉婷婷，陳英華，劉 勇，孫曉偉

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040;2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

痛風(fēng)是由尿酸鈉結(jié)晶(MSUC)沉積在關(guān)節(jié)周圍而引起的一種炎癥，臨床以關(guān)節(jié)劇痛伴腫脹發(fā)熱暗紅為主要表現(xiàn)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是痛風(fēng)最常見的首發(fā)癥狀，亦是痛風(fēng)的最基本的類型，典型發(fā)作一般多起病急驟，有時呈爆發(fā)性，多于午夜足痛驚醒，其疼痛性質(zhì)為刀割、咬噬樣，關(guān)節(jié)及周圍組織紅、腫、熱、痛，是由于體內(nèi)的嘌呤代謝紊亂所致的尿酸升高或排泄減少致尿酸鈉或尿酸結(jié)晶從超飽和的細(xì)胞外液沉積于組織所致的急性炎癥反應(yīng)［1～3］。為此，本研究以急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠為研究對象，對比觀察電針的不同波形對實(shí)驗(yàn)性大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中HSP70表達(dá)的影響，以篩選出臨床療效更佳的電針治療方法。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理

清潔級雄性Wistar大鼠120只，體重(255±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證號:黑動字第P00102005)。常規(guī)飼養(yǎng)1周后，將120只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，即空白組、模型組、電針疏波組、電針疏密波組、電針密波組，每組24只。

1．2 尿酸鈉溶液的制備

1 250 mg尿酸鈉晶體加45 ml生理鹽水，再加5 ml吐溫－80(失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚－80)，加熱攪拌，配成50 ml尿酸鈉溶液。

1．3 造模方法

模型制作按Coderre等經(jīng)典方法略作改進(jìn)，即用6號注射針從受試大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)背側(cè)，以45°方向插入脛骨肌腱內(nèi)側(cè)，將0.2 ml尿酸鈉溶液注入到踝關(guān)節(jié)腔，復(fù)制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。

1．4 針刺方法

各組動物分為1天、3天、5天3個時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)觀察8只，分別于實(shí)驗(yàn)第1天造模，造模3 h后開始進(jìn)行干預(yù)。

針具:0．25 mm×13 mm華佗牌無菌針灸針。取穴:病變側(cè)足三里、三陰交，穴位選取依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》的動物穴位圖譜，并以比較解剖和骨度分寸法為依據(jù)模擬定位［4］。

針刺方法:空白組:不造模，不治療;模型組:造模3 h后開始，每天與其它治療組動物同樣方法固定1次，每次20 min，連續(xù)5天;電針疏波組:將大鼠固定在特制的鼠架上，直刺“足三里”、“三陰交”，使其針感傳導(dǎo)，令“足三里”、“三陰交”構(gòu)成回路，然后連接SDZII型電針儀，正極在上，負(fù)極在下，選用疏波刺激，頻率為2 Hz，電壓為2 V，強(qiáng)度以見大鼠下肢肌肉收縮引起肢體輕微顫動為宜，每天1次，留針20 min，連續(xù)5天;電針密波組:同電針疏波組，但選用密波刺激，頻率為100 Hz，電壓為2 V，強(qiáng)度以見大鼠下肢肌肉收縮引起肢體輕微顫動為宜，每天1次，留針20 min，連續(xù)5天;電針疏密波組:同電針疏波組，頻率為2 Hz/100 Hz，電壓為2 V，強(qiáng)度以見大鼠下肢肌肉收縮引起肢體輕微顫動為宜，每年1次，留針20 min，連續(xù)5天。

1．5 采用PV免疫組化兩步法檢測滑膜細(xì)胞HSP70表達(dá)

①切片常規(guī)脫蠟到水;②3%H2O2中孵育10 min，PBS沖洗2 min 3次;③微波修復(fù):切片入枸椽酸鹽緩沖液(PH6)，微波爐中5 min 2次，中間間隔10 min。自然冷卻至室溫;④滴加一抗，4℃冰箱中過夜，PBS沖洗2 min 3次;⑤滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗2 min 3次;⑥D(zhuǎn)AB顯色5～10 min，蒸餾水充分沖洗;⑦蘇木素復(fù)染1 min;⑧常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料用One－Way ANOAY方差分析，組間比較選用LSD及S－N－K分析。文中數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

MSUC混懸液注射后，模型組與空白組比較HSP70表達(dá)增強(qiáng)，經(jīng)過治療，電針各組HSP70蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，說明電針各組均能上調(diào)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠HSP70含量。治療各時間點(diǎn)，電針疏波組與電針密波組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);電針治療第3、5天，電針疏密波組與電針疏波組及電針密波組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示電針疏密波組對上調(diào)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠HSP70蛋白含量的作用優(yōu)于電針疏波組及電針密波組。詳見表1。

表1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中HSP70表達(dá)的變化(平均灰度值，±s)

表1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中HSP70表達(dá)的變化(平均灰度值，±s)

注:與空白組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，☆P＜0.05;☆☆P＜0.01;與電針疏波組比較，▲P＜0.05;與電針密波組比較，★P＜0.05。

組別 動物(只) 1天 3天 5天147．63 ±29．55 148．14 ±28．36 148．5 ±31．04模型組 8 157．00 ±25．12* 159．75 ±27．85* 163．5 ±29．88＊＊電針疏波組 8 161．25±26．47＊＊☆ 163．88±29．23＊＊☆ 169．88±32．94＊＊☆電針密波組 8 163．13±28．15＊＊☆ 164．88±33．64＊＊☆ 170．13±34．27＊＊☆電針疏密波組 8 163．15±28．97＊＊☆ 172．25±32．82＊＊☆▲★ 181．75±35．38空白組8＊＊☆☆▲★

3 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是尿酸鈉鹽結(jié)晶引起的炎癥反應(yīng)。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)又稱“應(yīng)激蛋白”，是生物體在不利因素下誘導(dǎo)基因開放而合成的一組新蛋白質(zhì)，對維持細(xì)胞的正常狀態(tài)及功能有重要作用。HSP還是一種強(qiáng)烈的免疫原性分子，具有調(diào)節(jié)自身免疫過程的能力［5］?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為HSP70這種廣泛存在、進(jìn)化上高度保守的“分子伴侶”是細(xì)胞保護(hù)的物質(zhì)基礎(chǔ)，其在應(yīng)激狀態(tài)下，可以增強(qiáng)細(xì)胞對損害的耐受程度，維持細(xì)胞的正常功能代謝，提高細(xì)胞生存率［6］，保護(hù)細(xì)胞生命活動及蛋白質(zhì)以維持細(xì)胞生命;參與免疫調(diào)節(jié)，能保護(hù)細(xì)胞對抗TNF和內(nèi)毒素的損傷，還可引起宿主的抗感染免疫;在炎癥反應(yīng)中，具有保護(hù)組織避免受活性氧因子誘導(dǎo)的DNA鏈斷裂，類脂過氧化和保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)，因此在炎癥免疫性疾病中，HSP70在免疫方面發(fā)揮著重要的功能。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠踝關(guān)節(jié)局部組織僅見少量的HSP70蛋白表達(dá)，而急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠HSP70蛋白表達(dá)增高，這可能與炎癥細(xì)胞因子的刺激有關(guān)，是機(jī)體產(chǎn)生的一種自我保護(hù)反應(yīng)。電針可促進(jìn)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠局部組織大量表達(dá)HSP70蛋白，提示電針作為一種生理性適宜刺激(瞬間高溫)誘導(dǎo)體內(nèi)具有細(xì)胞保護(hù)作用的HSP70大量合成，可能是其治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的重要作用途徑之一。

上述結(jié)果可以看出電針各組均有上調(diào)HSP70蛋白表達(dá)的作用，電針疏波組和電針密波組作用相似，而電針疏密波組優(yōu)于電針疏波組和電針密波組。它為探討針灸效應(yīng)的機(jī)理研究提供了新的重要線索，毫無疑問，電針誘導(dǎo)HSPs的合成，從而對機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用，可能是針灸效應(yīng)的重要機(jī)制之一，有必要在此領(lǐng)域進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。

電針療法是傳統(tǒng)針刺與現(xiàn)代電針儀相結(jié)合應(yīng)用的一種療法，電針可起到補(bǔ)腎益精、舒筋通絡(luò)、消腫止痛的作用，其治療作用具有多層面、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，經(jīng)過中樞的整合后可有效的調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答以及細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，從而能有效減輕患者的臨床癥狀［7］。臨床研究中發(fā)現(xiàn)，電針疏通經(jīng)絡(luò)氣血運(yùn)行，從整體上雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫，有效地治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)亦證實(shí)電針能廣泛地激活神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)，調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)動物免疫功能，達(dá)到止痛、消腫、改善關(guān)節(jié)功能的目的。其次，電針儀制造技術(shù)成熟、各項參數(shù)穩(wěn)定，可保障實(shí)驗(yàn)過程中條件的統(tǒng)一性和可重復(fù)性，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更客觀、準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)中選用的華佗牌SDZ－II電針儀因其性能穩(wěn)定和良好的治療作用，在針刺研究中已被眾多研究者所采用。

電針治療本病取足三里、三陰交二穴相配，一陰一陽，可以鼓舞正氣、補(bǔ)益氣血、健脾和胃、祛濕化痰，從而使氣血運(yùn)行暢通，濕熱之邪隨之排出體外。以上二穴合用，能夠激發(fā)經(jīng)氣，活血通絡(luò)，祛邪外出，共奏標(biāo)本同治之功。通過以上試驗(yàn)，電針足三里、三陰交穴后，對實(shí)驗(yàn)動物起到消腫止痛、扶正祛邪的治療作用。從細(xì)胞和分子水平使失衡的免疫系統(tǒng)及神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)趨于穩(wěn)定。電針具有很好的抗炎止痛效果，使用電針增強(qiáng)腧穴刺激，通過神經(jīng)傳導(dǎo)提高機(jī)體痛閾，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)，減少了癥狀“反跳”的發(fā)生?？傊?，電針對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有很好的療效，具有療效好、不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)，為臨床中西醫(yī)結(jié)合綜合療法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供了一種新方法，值得推廣。

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