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    黃瓜L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯脫氫酶cDNA全長的克隆和遺傳轉(zhuǎn)化

    2012-03-12 06:43:12苑志明勞杉杉秦智偉周秀艷
    東北農(nóng)業(yè)大學學報 2012年7期
    關鍵詞:東北農(nóng)業(yè)大學逆轉(zhuǎn)錄瓊脂糖

    苑志明,勞杉杉,秦智偉,周秀艷

    (東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院,哈爾濱 150030)

    維生素C別名抗壞血酸(Ascorbic acid,AsA),是藻類、高等植物和大多數(shù)動物體內(nèi)合成的一種己糖內(nèi)酯化合物??箟难峥梢郧宄矬w內(nèi)代謝產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxidative species,ROS),一定濃度的ROS是生物體內(nèi)必須的,但ROS濃度過高會造成細胞損傷,引起生物衰老和死亡,逆境會造成植物體內(nèi)ROS升高[1]。高等植物抗壞血酸合成的L-半乳糖途徑中,L-半乳糖-1,4內(nèi)酯由GalLDH直接氧化成抗壞血酸,GalLDH是抗壞血酸合成過程中的關鍵酶之一[2]。

    由于人體內(nèi)缺乏抗壞血酸合成過程中的關鍵酶,只能從食物中攝取[3]。因此,園藝產(chǎn)品中的AsA含量已成為衡量品質(zhì)的重要指標。黃瓜中抗壞血酸含量較低,到目前為止沒有研究能解釋這種現(xiàn)象。本試驗通過克隆黃瓜中抗壞血酸合成的關鍵酶GalLDH,為今后研究黃瓜中抗壞血酸含量較低的原因,改良黃瓜的營養(yǎng)品質(zhì)奠定一定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試材料為黃瓜D08108果肉,由東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院黃瓜課題組提供。雌花自然開花后10 d采樣,將果肉切成薄片用錫紙包好,并用液氮速凍后存于-80℃冰箱,用于提取RNA。將幼嫩的番茄(HN11)葉片稱取0.2 g用錫紙包好,并用液氮速凍后存于-80℃冰箱,用于提取DNA。番茄品種由東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院提供。

    載體pBI121和農(nóng)桿菌由東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院實驗室提供。黃瓜組織培養(yǎng)外植體選用栽培品種649,由東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院黃瓜課題組提供。

    1.2 應用RT-PCR克隆黃瓜GalLDH

    1.2.1 總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄

    稱取0.5 g果肉用Trizol法提取RNA,用SMA3000分光光度計檢測,用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。選用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,取2 μL RNA用于逆轉(zhuǎn)錄,取3 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA質(zhì)量。

    1.2.2 RT-PCR

    根據(jù)GenBank中登錄的甜瓜GalLDH(AF252339.2)的基因序列設計引物,SGalLDH:5'GTTGGGG AATCATAAACC 3'和AGalLDH:5'AAACACTTATC CAACTGGACAAC 3'。以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,用SGalLDH和AGalLDH進行PCR,反應條件為:94℃5 min預變性后,94℃30 s,56℃30 s,72℃1 min,循環(huán)35次,最后72℃延伸10 min。

    1.2.3 PCR產(chǎn)物回收與測序

    將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳30 min,百泰克多功能小量DNA回收試劑盒進行膠回收,連接到pEASY-T3載體(全式金)上,然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株中,并涂在含有50 mg·mL-1Amp+、IPTG和X-gal的LB平板上,挑選白色菌落,放入含有Amp+的5 mL液體LB培養(yǎng)基中,37℃條件下,200 r·min-1,過夜。百泰克質(zhì)粒小量回收試劑盒提取質(zhì)粒,F(xiàn)ermentas快速內(nèi)切酶Eco RⅠ37℃酶切5 min,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段。由上海英駿生物技術有限公司完成測序。

    1.3 2A12果實特異性啟動子的克隆

    CTAB法提取番茄幼嫩葉片DNA,擴增2A12基因的引物序列為S2A12:5'AGCACTTGTTAGA CTCATCTG 3'和 A2A12:5'AATGGTTTTGGATTA ATTGC 3',以番茄DNA為模板進行PCR擴增。

    1.4 酶切位點的添加

    在S2A12添加HindⅢ位點即M-S2A12:5'GT CAAGCTTAGCACTTGTTAGACTCATCT 3',在A2A12上添加XbaⅠ位點即M-A2A12:5'GTATCTAGAAA TGGTTTTGGATTAATTGC 3'。在SGalLDH上添加XbaⅠ位點即M-SGalLDH:5'GTCTCTAGAGTTGGG GAATCATAAACC 3',在AGalLDH上添加SmaⅠ位點即M-AGalLDH:5'GATCCCGGG AAACACTTATC CAACTGGACAAC 3'。

    1.5 表達載體的構(gòu)建和檢測

    對含有GalLDH目的片段(已添加酶切位點)的pEASY-T3載體和pBI121分別用Fermentas快速內(nèi)切酶XbaⅠ和SmaⅠ進行雙酶切,進行膠回收,然后用Fermentas T4連接酶進行連接;將連接好的中間載體和含有2A12基因(已添加酶切位點)的pEASY-T3載體分別用Fermentas快速內(nèi)切酶HindⅢ和XbaⅠ進行雙酶切,進行膠回收,然后用Fermentas T4連接酶進行連接,將連接好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。用CTAB法提取黃瓜總DNA。

    1.6 黃瓜GalLDH的cDNA生物學分析

    采用Primer premier 5.0軟件進行引物設計,由ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析開放閱讀框;采用ExPASy的ProtParam Tool(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)分析編碼氨基酸理化性質(zhì);應用TreeView和CLUSTALX進行序列比對和進化樹構(gòu)建分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1RNA的質(zhì)量、黃瓜GalLDH的RT-PCR擴增

    提取黃瓜D08108果肉的總RNA,用SMA3000分光光度計檢測,OD260/280≈1.8,3015 ng·μL-1,取3 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量見圖1(A),以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行RT-PCR擴增,獲得一條1880 bp的特異性條帶見圖1(B)。

    圖1 黃瓜果實總RNA(A)及GalLDH基因的RT-PCR擴增(B)Fig.1 Total RNA(A)and RT-PCR product of GalLDH(B)from fruit of cucumber cultivar D08108

    2.2 黃瓜GalLDH的生物學分析

    黃瓜GalLDH經(jīng)測序是一個全長為1880 bp cDNA序列,包含一個長為1773 bp的完整開放閱讀框,在5'端有47 bp的非編碼序列,在3'端有60 bp的非編碼序列。其GenBank登錄號:HQ446099,堿基序列及推導的氨基酸序列如圖2所示,通過與GenBank中登錄的同源基因進行核苷酸相似度比較,黃瓜GalLDH與甜瓜相似度最高,為96%,與獼猴桃相似度為76%,與其他物種相似度均在70%以上。

    圖2 植物GalLDH基因氨基酸序列系統(tǒng)樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of plant GalLDH gene

    黃瓜GalLDH氨基酸序列的分子質(zhì)量為67297.2,理論等電點9.04,氨基酸數(shù)590,親水性平均值-0.475,不穩(wěn)定指數(shù)48.30,為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

    2.3 表達載體構(gòu)建的檢測

    對構(gòu)建好的載體進行用SGalLDH:5'GTTGGG GAATCATAAACC 3'和 AGalLDH:5'AAACACTTAT CCAACTGGACAAC 3'、S2A12:5'AGCACTTGTTA GACTCATCTG 3'和A2A12:5'AATGGTTTTGGATT AATTGC 3'進行PCR檢測,得到一條1880 bp的目的條帶和一條850 bp的目的條帶(見圖3)。

    圖3 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.3 Detection of recombinant plasmid by PCR

    2.4 轉(zhuǎn)基因黃瓜的檢測

    選用2A12啟動子的特異引物對轉(zhuǎn)基因黃瓜進行檢測,共得到13株再生植株,其中轉(zhuǎn)基因植株5株。轉(zhuǎn)基因陽性植株擴增條帶與預期一致,陰性植株沒有擴增出條帶,第1道是構(gòu)建載體,第2道是陰性對照,3~7道是擴增出的陽性條帶(見圖4)。組培圖片中A是子葉節(jié),B是組培苗,C是組培苗的生根過程,D是馴化中的組培苗(見圖5)。

    圖4 轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的PCR檢測Fig.4 Detection of transgenic Cucumis sativus by PCR

    圖5 黃瓜組培Fig.5 Cucumber tissue culture

    3 討論與結(jié)論

    抗壞血酸含量的高低是衡量園藝產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標之一[4],抗壞血酸在光合作用和光合保護中起重要作用[5-6]。抗壞血酸還可以作為一系列重要酶反應的輔因子[3],抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的相對比率影響植物的細胞分裂[7]。高等植物抗壞血酸的合成主要是通過L-半乳糖途徑,但是也不排除其他途徑的可能[8]。本試驗中克隆的GalLDH在高等植物中普遍存在。目前造成黃瓜抗壞血酸含量低的原因并不明確,因為抗壞血酸參與植物體內(nèi)大量的代謝活動,一直處在一個動態(tài)平衡的條件下。因此通過黃瓜GalLDH的克隆,為黃瓜中抗壞血酸含量的研究奠定基礎,為今后黃瓜抗壞血酸的研究起到輔助作用。不足之處,由于試驗使用的是果實特異啟動子,組培苗并未結(jié)瓜,所以無法檢測其抗壞血酸的含量變化。

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    [4] Eskling M,Avridsson P O,Akerlund H E.The xanthophylls cycle,its regulation and components[J].Physiol Palnt,1997,100:806-816.

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