三株生防細菌對黃瓜白粉菌生防作用的掃描電鏡觀察

范瑛閣，方海晶，李 莎

（1.塔里木大學植物科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3.霍城縣農產品質量安全檢測中心，新疆 庫爾勒 835200）

黃瓜白粉病由葫蘆科白粉菌Erysiphe cucurbitacearum Zheng et chen或單絲殼白粉菌Sphaerotheca fuligenea（Schlecht）Poll引起[1]，其病原物在黃瓜整個生育期均可侵染。近年來隨著保護地栽培的發(fā)展，白粉病的危害愈加嚴重[2-3]。目前，生產上防治主要采用化學藥劑，但化學農藥引起新的病蟲害大發(fā)生、污染農產品及環(huán)境等問題已成為國際上研究的焦點。隨著環(huán)境法規(guī)制定普及和公眾環(huán)保意識的加強，蔬菜生產應少含或不含化學殘留物，特別對于新疆沙漠化半干旱、半鹽堿化的脆弱生態(tài)環(huán)境，生態(tài)平衡恢復能力、環(huán)境污染修復能力相對較弱地區(qū)，更應減少化學農藥的使用，以減少生態(tài)環(huán)境壓力保持農業(yè)可持續(xù)發(fā)展[4]。利用微生物防治黃瓜白粉病的研究國內外均有報道。陳麗等報道放線菌S-930-6精提物800 mg·L-1對西葫蘆白粉病的保護和治療作用分別為91%和97%[5]；Romero等研究三種微生物對黃瓜白粉病的防效進行測定，三種微生物包括基于白粉寄生孢（Ampelomyces quisqualis）的AQ10、基于蠟蚧輪枝菌（Lecanicillium lecanii）的生物產品Mycotal和枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis），結果表明枯草芽胞桿菌對瓜類白粉病的效果接近于兩種重寄生菌和醚菊酯農藥對照[6]。在生防機理方面，也有關于防御酶系、促生作用和拮抗作用的報道[7-10]。生防細菌H1、H2和H3從黃瓜根際分離，對黃瓜白粉病防效顯著[11]。生防細菌對植物病害的生防機理通常有抗生作用、溶菌作用、重寄生作用、誘導抗性、競爭作用等，而抗生作用主要表現(xiàn)為有益微生物的拮抗作用[12-13]。本研究通過掃描電鏡直接觀察的方法，從拮抗機理、重寄生現(xiàn)象和溶菌作用方面，揭示生防菌對黃瓜白粉菌的作用位點和作用機理。白粉菌為專性寄生菌，不能采用對峙培養(yǎng)等傳統(tǒng)方法進行測定，針對這一問題，結合前人研究的基礎[14-15]，本研究利用掃描電鏡的方法探索三株生防細菌對白粉病菌的作用位點以及白粉菌的超微結構變化，探討其抗病機理，為我國主要植物病害有效防治奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試黃瓜品種為白粉菌易感品種長春密刺。供試生防菌H1、H2、H3由新疆地區(qū)蔬菜根際分離得到。

1.2 方法

1.2.1 田間小區(qū)劃分

在塔里木大學試驗田選取靠近水源地塊，劃分四個小區(qū)，春灌、深翻、平整、起壟。2011年4月28日，黃瓜種子保濕催芽48 h后種植，5月28日間苗，每小區(qū)定苗50棵并搭架。

1.2.2 拮抗作用前期處理

①待黃瓜開花期，接種白粉菌，見葉片上有稀疏白粉菌斑后開始培養(yǎng)生防菌。②生防菌H1、H2、H3用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，配制成108cfu·mL-1的菌懸液，用噴壺均勻噴施于黃瓜葉片表面，田間培養(yǎng)12、24、36、48 h后隨機取葉片備用，3次重復，以噴施清水為對照。

1.2.3 電鏡觀察樣品制備

①取處理后的黃瓜葉片，剪取有白粉病斑處5 cm大小，戊二醛過夜固定；②磷酸緩沖液浸泡2次，每次15 min；然后在10%、20%、30%、50%、70%、90%梯度酒精浸泡，每次15 min；最后100%酒精浸泡2次，每次20 min；③叔丁醇沖洗2次，最后1次放4℃冰箱固化；④K750X冷凍干燥機冷凍干燥；⑤ETD-2000小型離子濺射儀鍍金；⑥SUPRA 55VP ZEISS掃描電鏡觀察，拍照。

2 結果與分析

2.1 拮抗作用的觀察

如圖版Ⅰ-A所示，清水處理的菌絲粗壯、完整、表面光滑。經H1處理12 h后的白粉菌絲完整、表面光滑，菌絲表面少量的細菌菌體附著（見圖版Ⅰ-B）；H1處理24 h后的菌絲完整、可見大量生防菌體附著表面，說明生防菌H1可以在細菌菌絲上定植，并且大量繁殖（見圖版Ⅰ-C）；處理36 h后，可見有菌絲體斷裂，并且斷裂處常有大量生防菌體定植（見圖版Ⅰ-D）；48 h后菌絲斷裂、扭曲、變形嚴重，在菌絲扭曲變形處滋生大量H1菌體，其原因可能是H1產生的拮抗物質對菌絲的拮抗作用（見圖版Ⅰ-E）。經H2處理12 h后的白粉菌絲粗壯、完整，菌絲表面發(fā)現(xiàn)有少量H2菌體（見圖版Ⅰ-F）；24 h后，發(fā)現(xiàn)菌絲表面H2菌體數(shù)量增多，并且有成堆聚生的現(xiàn)象，可能是由于H2在白粉菌絲表面大量繁殖造成的，并發(fā)現(xiàn)白粉菌絲有變形，凹陷現(xiàn)象（見圖版Ⅰ-G）；36 h后，菌絲變形、扭曲加劇，在H1聚集處多發(fā)現(xiàn)白粉菌菌絲斷裂現(xiàn)象，可能是由于H2產生的拮抗物質刺激所致（見圖版Ⅰ-H）；48 h后，白粉菌絲破裂嚴重，圖版Ⅰ-I中所示為白粉菌絲破裂處聚集大量H2菌體。經H3處理12 h后，白粉菌絲表面可見少量H3菌體（見圖版Ⅰ-J），處理24 h后，白粉菌絲表面H3菌體增多（見圖版Ⅰ-K）；處理36 h后，白粉菌絲扭曲、變形，菌絲表面生防菌體大量繁殖（見圖版Ⅰ-L）；處理48 h后，H3菌體在菌絲上大量繁殖，白粉菌絲扭曲變形，向內凹陷（見圖版Ⅰ-M）。

圖版Ⅰ H1、H2和H3三種生防菌對黃瓜白粉菌生長狀態(tài)的影響PlateⅠ Effect of bio-control bacteria H1,H2 and H3 on the growth of cucumber powdery mildew

2.2 溶菌作用的觀察

生防菌H1、H2、H3對黃瓜白粉菌溶菌作用的測定如圖版Ⅰ所示。圖版中的D和E圖為H1處理36和48 h后的白粉菌絲，兩圖中均發(fā)現(xiàn)有菌絲破裂、溶解現(xiàn)象，并在溶解處多有H1菌體聚生，說明H1具有溶菌作用；圖版中的H圖和I圖為H2處理36和48 h后的白粉菌菌絲，僅發(fā)現(xiàn)在H2菌體定植處白粉菌菌絲有斷裂現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)菌絲的溶解，說明H2對黃瓜白粉菌絲無溶解作用；圖版中的L圖和M圖為H3處理36和48 h后的白粉菌菌絲，從圖中可見白粉菌絲雖有變形、扭曲，但沒有破裂、溶解現(xiàn)象，說明H3對黃瓜白粉菌絲也不具有溶菌作用。

2.3 重寄生作用的觀察

生防菌H1、H2、H3對黃瓜白粉重寄生作用的測定如圖版Ⅰ所示。生防菌H1、H2和H3處理后的菌絲表面均發(fā)現(xiàn)有菌體大量繁殖現(xiàn)象，但只能證明生防菌在白粉菌菌絲表面繁殖，沒有發(fā)現(xiàn)細菌菌體的作用位點。

3 討論與結論

黃瓜白粉菌為專性寄生菌，不能在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因此，對峙培養(yǎng)觀察拮抗作用的方法不適于黃瓜白粉菌的研究。本研究根據Fakhouri和馬青研究結果[14-15]，利用掃描電鏡直接觀察方法來探討生防菌對黃瓜白粉菌的作用機理。通過不同時期的觀察證實，生防菌H1對白粉菌具有拮抗和溶菌作用，無重寄生作用；生防菌H2和H3對黃瓜白粉菌均具有拮抗作用，無溶菌和重寄生作用。

研究結果進一步證實，利用掃描電鏡觀察專性寄生菌的拮抗作用、溶菌作用和重寄生作用是可行的，但要觀察白粉菌絲內部細胞生理變化，需要借助投射電鏡的超薄切片觀察。

Romero等利用掃描和投射電鏡觀察到，枯草芽胞桿菌對黃瓜白粉病的拮抗作用表現(xiàn)為對白粉菌細胞的破壞而阻止孢子萌發(fā)，枯草芽胞桿菌對瓜類白粉病的拮抗作用關鍵因素是生防菌能夠定植于黃瓜葉面[6]。

[1] 董金皋,李洪連,朱杰華,等.農業(yè)植物病理學(北方本)[M].北京:中國農業(yè)出版社,2001.

[2] 陳福良,王儀,鄭斐能,等.氟硅唑微乳劑的研制[J].農藥,2004,43(12):544-546.

[3] 陸金元,徐永昌,陸燕,等.幾種藥劑防治大棚黃瓜白粉病的比較試驗[J].上海蔬菜,2004(4):57.

[4] 丁建麗,塔西甫拉提·特依拜,熊黑剛,等.塔里木盆地南緣綠洲土地覆蓋變化[J].地理學報,2002,57(1):21-22.

[5] 陳麗,安德榮,白萍.拮抗放線菌S-930-6發(fā)酵液精提物對幾種作物病害的防治效果[J].農藥,2004,43(3):120-122.

[6] Romero D,de Vicente A,Zeriouh H,et al.Evaluation of biological control agents for managing cucurbit powdery mildew on greenhouse-grown melon[J].Olant Pathology,2007(56):976-986.

[7] 楊文香,張汀,劉大群.三株鏈霉菌對黃瓜白粉病及黃瓜生長的影響[J].河北農業(yè)大學學報,2005,28(4):80-83.

[8] 郭敬華,孟慶芳,李亞寧.玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63發(fā)酵液對黃瓜白粉病抗性的影響[J].華北農學報,2007,22(增):1-4.

[9] 魏國強,錢瓊秋,朱祝軍.黃瓜白粉病抗性及生理機制的研究[J].華北農學報,2004,19(2):84-86.

[10] 霍云霞,何其瑞,魏國榮.兩株內生放線菌發(fā)酵液防治黃瓜白粉病機理初探[J].西北農業(yè)學報,2009,18(6):295-300.

[11] 范瑛閣,龔明福,朱麗霞.黃瓜白粉病菌生防菌篩選及生防機制初步研究[J].北方園藝,2010,221(14):150-152.

[12] 黃云.植物病害生物防治學[M].北京:科學出版社,2010.

[13] 吳云峰.植物病蟲害生物防治學[M].北京:中國農業(yè)出版社,2008.

[14] Fakhouri W,Kang Z,Buchenauer H.Ultrastructural studies on the mode of action of Fluorescent pseudomonads alone and in combination with acibenzolar-S～methyl effective against Fusarium oxysporurn f.sp.lycopersici in tomato plant[J].Journal of Plant Diseases and Protection,2001,108(5):513-529.

[15] 馬青,孫輝,杜昱光,等.氨基寡糖素對黃瓜白粉病菌侵染的抑制作用[J].菌物學報,2004,23(3):423-428.