腺病毒與慢病毒載體轉(zhuǎn)染離體兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的有效性對比研究

蘭 芬 杜之渝 黃 正 吳寧玲

隨著準(zhǔn)分子激光角膜屈光手術(shù)方式由表及里而后又逐漸回歸到表面切削，各種角膜表面屈光手術(shù)均不能完全避免角膜Haze的發(fā)生，因此，尋找一種新的安全有效的防治角膜Haze的方法意義重大，而基因治療為角膜Haze的防治帶來了新希望［1-2］。本研究通過比較腺病毒載體(adenovirus vector，AV)與新型慢病毒載體(lentivirus vector，LV)介導(dǎo)增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent proteins，EG-FP)報告基因轉(zhuǎn)染離體兔角膜基質(zhì)細(xì)胞(rabbit corneal stroma cells，RCSC)的有效性，探討較優(yōu)一種病毒載體轉(zhuǎn)染角膜基質(zhì)細(xì)胞(corneal stroma cells，CSC)的可行性，為下一步依靠此載體介導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)染角膜基質(zhì)，抑制CSC增生及其相關(guān)的動物活體實驗提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及主要試劑 健康新西蘭大白兔6只，雌雄兼用，體質(zhì)量為1.8～2.5 kg。LV-EGFP及AV-EGFP購于北京本元正陽基因技術(shù)股份有限公司;DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司;鼠抗兔波形纖維蛋白一抗和羊抗小鼠IgG-FITC二抗購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱、倒置熒光顯微鏡均由眼科學(xué)重慶市市級重點實驗室提供;流式細(xì)胞儀由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 RCSC的培養(yǎng)和鑒定 無菌條件下取出兔眼球，剪下角膜組織，然后分離出基質(zhì)層，剪成10～20小塊(大小約2 mm×2 mm)放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合后按1∶3傳代。取原代和傳代細(xì)胞按細(xì)胞密度為10×106L－1制備細(xì)胞爬片，然后應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)方法對培養(yǎng)細(xì)胞進行鑒定。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 把濃度為20×106L－1的RCSC懸液接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔500 μL，培養(yǎng)過夜。第2天取出，棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，然后將AV-EGFP與LV-EGFP按感染復(fù)數(shù)(即MOI)=0、1、10、50、100、500、1000、10×103用空白培養(yǎng)基稀釋后加入培養(yǎng)板中(MOI是指每個細(xì)胞感染的病毒數(shù)，其中MOI=0為對照組，加入等量的空白培養(yǎng)基)，每孔200 μL。培養(yǎng)6 h后換新鮮完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清500 μL)常規(guī)培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h，倒置熒光顯微鏡下觀察RCSC中EGFP的表達情況并拍照。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染率 取0.1×109L－1的傳2代細(xì)胞懸液1 mL接種于無菌培養(yǎng)瓶中，按照MOI=0、1、10、50、100、500、1000、10×103的上述方法分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72 h取出，用胰酶消化后離心，加入PBS液制成細(xì)胞懸液，送流式檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 轉(zhuǎn)染率數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對計量資料進行小樣本均數(shù)t檢驗及方差分析，對組間兩兩比較采用SNK兩兩比較分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 RCSC多呈長梭形，整體亦呈放射狀或螺旋狀，生長較快，一般3～5 d融合(圖1)。細(xì)胞鑒定結(jié)果:RCSC胞漿中特異性表達波形纖維蛋白，胞漿發(fā)亮綠色熒光，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，不發(fā)亮熒光(圖2)。

Figure 1 The condition of subculturing RCSC at the 5th day(× 50)RCSC傳代培養(yǎng)第5天生長情況(×50)

Figure 2 Positive expression of Vimentin in cytoplasm of RCSC(× 200) 波形纖維蛋白在RCSC胞漿陽性表達(×200)

2.2 轉(zhuǎn)染結(jié)果

2.2.1 倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染起效時間及EGFP在RCSC的表達 AV-EGFP轉(zhuǎn)染RCSC從24～48 h開始可見明顯的綠色熒光，LV-EGFP轉(zhuǎn)染RCSC 48 h后開始見綠色熒光，晚于AV-EGFP轉(zhuǎn)染組。倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP在細(xì)胞中表達呈綠色或黃綠色，彌漫整個胞漿和胞核，細(xì)胞起始表達強度不一，隨著時間延長及感染復(fù)數(shù)增強表達亦增強，對照組未見綠色熒光表達(圖3-圖4)。

2.2.2 流式細(xì)胞儀檢測兩組RCSC轉(zhuǎn)染率結(jié)果轉(zhuǎn)染后72 h流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率結(jié)果與上述觀察結(jié)果一致。LV-EGFP轉(zhuǎn)染組在MOI≤1000時，隨著MOI值增大，檢測到的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率逐漸增大，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.05，見表1);在MOI=10×103與MOI=1000時，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明LV-EGFP轉(zhuǎn)染組在MOI為1000與10×103時對RCSC的轉(zhuǎn)染率無差別，在MOI=1000時可達有效轉(zhuǎn)染。在AV-EGFP轉(zhuǎn)染組中，MOI=1與MOI=10時轉(zhuǎn)染率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞ 0.05)，說明當(dāng)感染復(fù)數(shù)為1與10時，AV-EGFP轉(zhuǎn)染RCSC后72 h轉(zhuǎn)染率無差別;MOI＞10時，隨著MOI值增大，檢測到的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率逐漸增大，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.05，見表1)。

Figure 3 The expression of EGFP in RCSC at different MOI and different time points in AV-EGFP transfective groups(×50)AV-EGFP轉(zhuǎn)染組在不同感染復(fù)數(shù)與不同時間時EGFP在RCSC中的表達(×50)

Figure 4 The expression of EGFP in RCSC at different MOI and different time point in LV-EGFP transfective groups(×50)LV-EGFP轉(zhuǎn)染組在不同感染復(fù)數(shù)與不同時間時EGFP在RCSC中的表達(×50)

轉(zhuǎn)染后72 h在同一MOI值下，當(dāng)MOI=1時，AV-EGFP轉(zhuǎn)染組與LV-EGFP轉(zhuǎn)染組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.35)，說明在極低濃度下，兩病毒載體均不能有效轉(zhuǎn)染RCSC。當(dāng)1000≥MOI＞1時，AV-EGFP與LV-EGFP轉(zhuǎn)染組比較，LV-EGFP轉(zhuǎn)染效率明顯高于AV-EGFP轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.05，見表1)。

3 討論

本研究在國內(nèi)首次采用LV轉(zhuǎn)染離體RCSC，并與AV進行比較，觀察兩病毒載體用于轉(zhuǎn)染RCSC的可行性，本研究表明，LV與AV均能有效轉(zhuǎn)染RCSC，且在同一感染復(fù)數(shù)下(MOI＞1)，LV轉(zhuǎn)染RCSC的效率要高于AV。

表1 流式細(xì)胞儀檢測兩組轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞轉(zhuǎn)染率Table 1 The transfection efficiency of transfective group and contrast group by flow cytometry (rate/%)

本研究顯示，各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞起始表達熒光的時間及強度不一致，AV-EGFP組轉(zhuǎn)染起始時間早于LV-EGFP組，可能是由于兩種病毒載體各自的轉(zhuǎn)染機制不同所形成。LV基因組是單鏈RNA，其基因組進入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中，整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達目的蛋白［3］。而AV的基因組是雙鏈DNA，其基因組進入細(xì)胞后，通過核孔直接將DNA釋放到細(xì)胞核內(nèi)，其基因組不整合到宿主細(xì)胞基因組中，而是自我進行一系列復(fù)雜有序的剪切和轉(zhuǎn)錄過程，并回到胞漿中表達目的蛋白［4］，可能是由于AV未進行逆轉(zhuǎn)錄，也未將目的基因整合入宿主細(xì)胞基因組，故轉(zhuǎn)染起效時間早于LV。

本研究顯示，在同一MOI值(MOI＞1)下AV的轉(zhuǎn)染效率要明顯低于LV，原因如下:(1)病毒載體要進入細(xì)胞，多數(shù)通過病毒與細(xì)胞表面的特定受體相結(jié)合。腺病毒感染也是通過受體介導(dǎo)的，腺病毒衣殼的球部對柯薩奇/腺病毒受體(coxsackie and adenovirus receptor，CAR)具有高親和力，而上皮細(xì)胞可高表達CAR受體，因此，AV對上皮細(xì)胞有較高的感染率，具有嗜上皮性。有研究證實，AV對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率可達到100%［5］。Ulasov等［6］發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞上缺乏Ad5的主要受體CAR，而Ad3受體CD46過表達，于是構(gòu)建了Ad5/3嵌合體，明顯增加了轉(zhuǎn)染率及靶向性，提高了Ad5介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤基因治療療效。也有研究報道腺病毒對一些細(xì)胞表面，尤其是成熟肌細(xì)胞表面缺少腺病毒受體，從而影響AV轉(zhuǎn)染的效率和靶向性［7］。而我們觀察到AV對RCSC未體現(xiàn)其高轉(zhuǎn)染率的優(yōu)越性，可能與RCSC表面相關(guān)受體種類有關(guān)。(2)當(dāng)外源基因進入細(xì)胞后，只有在適宜的啟動子及調(diào)控基因作用下細(xì)胞才開始表達基因產(chǎn)物。常用的啟動子為CMV啟動子、SV40啟動子和組織特異性啟動子。而靶細(xì)胞的特異性啟動子可使病毒載體保持相對穩(wěn)定高效及特異的表達功能。有文獻報道角蛋白-12啟動子在體外實驗中可在角膜細(xì)胞表達［8］，而不在成纖維細(xì)胞表達，角蛋白-12/角蛋白-3啟動子可在角膜上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞中表達，而不在其他細(xì)胞中表達。因此，我們推斷AV轉(zhuǎn)染RCSC效率低可能還與RCSC內(nèi)特異性啟動子種類與含量多少有關(guān)。

由于細(xì)胞生長受限，無法觀察比較兩種病毒載體轉(zhuǎn)染后表達持續(xù)時間。有報道AV轉(zhuǎn)染目的基因在動物活體上可持續(xù)表達約28 d［9］，LV轉(zhuǎn)染目的基因至眼部虹膜內(nèi)可持續(xù)表達約90 d［10］，而對于RCSC來說，兩種病毒載體究竟能夠持續(xù)穩(wěn)定表達多久，我們在后續(xù)動物活體實驗中將進行深入研究。同時，一種理想的基因載體除了能夠有效地轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞外，還要求對靶細(xì)胞無毒副作用，因此，兩種病毒載體用于CSC的轉(zhuǎn)染安全性還有待深入研究探討。

1 Klausner EA，Peer D，Chapman RL，Multack RF，Andurkar SV.Corneal gene therapy［J］.J Control Release，2007，124(3):107-133.

2 李 臻，趙 敏.角膜病基因治療的研究進展［J］.中國實用眼科雜志，2006，24(4):345-348.

3 羅 望，張 泓，許 淼，顧 林，孫倍成.慢病毒-基因轉(zhuǎn)移的潛在新載體［J］.江蘇藥學(xué)與臨床研究，2006，14(6):366-371.

4 范凌云，謝慶軍.腺病毒載體的研究進展［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2008，21(2):153-157.

5 張關(guān)霞，吳 靜，辛 梅，張軍軍，閆乃紅，嚴(yán) 密，等.腺病毒介導(dǎo)人內(nèi)皮抑素感染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的可行性研究［J］.眼視光學(xué)雜志，2009，11(4):265-268.

6 Ulasov IV，Tyler MA，Zheng S，Han Y，Lesniak MS.CD46 represents a target for adenoviral gene therapy of malignant glioma［J］.Hum Gene Ther，2006，17(5):556-564.

7 Bramson JL，Grinshtein N，Meulenbroek RA，Lunde J，Kottachchi D，Lorimer IA，et al.Helper-dependent adenoviral vectors containing modified fiber for improved transduction of developing and mature muscle cells［J］.Hum Gene Ther，2004，15(2):179-188.

8 劉宏偉，王香蘭.外源基因在角膜中表達及基因治療［J］.眼科研究，2001，19(1):84-86.

9 Oral HB，Larkin DF，F(xiàn)ehervari Z，Byrnes AP，Rankin AM，Haskasd DO，et al.Ex vivo adenovirus-mediated gene transfer and immunomodulatory protein production in human cornea［J］.Gene T-her，1997，4(7):639-647.

10 Stout JT.Gene transfer for the treatment of neovascular ocular disease［J］.Trans Am Ophthalmol Soc，2006，104(4):530-560.