莖環(huán)法RT-qPCR定量檢測(cè)細(xì)胞抗豬瘟病毒siRNA的表達(dá)

劉帥，李江南，袁婷，楊凡力，逄大欣，涂長(zhǎng)春

1 吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130122

RNAi作為一種有效的抗病毒工具，已成功應(yīng)用于抑制人體免疫缺損病毒Ⅰ型 (HIV-1)[1]、SARS冠狀病毒 (SARS-CoV)[2]等多種病毒的復(fù)制增殖。豬瘟 (Classical swine fever，CSF) 是由豬瘟病毒 (Classical swine fever virus，CSFV) 引起的一種高度接觸性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失。CSFV是有囊膜的正鏈RNA病毒，基因組RNA兼具復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能，且非結(jié)構(gòu)蛋白基因保守性比較高[3]，提供了理想的RNAi靶位點(diǎn)。為應(yīng)用RNAi技術(shù)構(gòu)建抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因豬，本研究小組曾針對(duì) CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白基因Npro成功設(shè)計(jì)了2個(gè)siRNA——siN1和siN2[4]，并構(gòu)建了相應(yīng)的siRNA表達(dá)載體——pLox-siN1和pLox-siN2[5-6]，在細(xì)胞水平通過(guò)檢測(cè)病毒的復(fù)制和增殖水平，證明了siN1和siN2對(duì)CSFV有顯著的抑制效果，但是，抗性細(xì)胞中siRNA的表達(dá)檢測(cè)卻制約了RNAi效果的評(píng)價(jià)。所以亟需建立一種準(zhǔn)確而簡(jiǎn)便的siRNA定量檢測(cè)方法，對(duì)抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因豬 siRNA的表達(dá)水平及組織表達(dá)差異進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)及評(píng)價(jià)。

目前，已有多種siRNA、miRNA (microRNA)等小RNA的檢測(cè)方法。Northern blotting[7]仍是小RNA檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但其特異性和靈敏度不高。而基于LNA (Locked nucleic acid) 標(biāo)記探針的新型 Northern blotting[8]雖然顯著改善了檢測(cè)靈敏度和特異性，但仍存在操作步驟繁瑣、需樣品量大、可檢測(cè)范圍低等缺點(diǎn)，更難于準(zhǔn)確定量。然而，多種實(shí)時(shí)定量PCR方法[9-16]被開(kāi)發(fā)出來(lái)定量miRNA的表達(dá)水平，常用的包括Poly (A) 加尾法[15]和莖環(huán)引物法[16]。前者可同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄細(xì)胞內(nèi)所有的 miRNA，成本低但靈敏度和特異性均不如后者，適合于miRNA的大量篩選工作。后者創(chuàng)新地設(shè)計(jì)了具有穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)的莖環(huán)引物，比常規(guī)線性引物有更高的特異性和靈敏度，并聯(lián)合特異性MGB探針，使其可精確區(qū)分同家族高度同源的miRNA，重要的是僅對(duì)成熟miRNA進(jìn)行檢測(cè)，而不受其前體 (Pre-miRNA) 干擾。但每種miRNA都需要設(shè)計(jì)一個(gè)對(duì)應(yīng)的莖環(huán)引物和MGB探針，成本高且操作相對(duì)繁瑣，所以適于少數(shù)靶基因的定量檢測(cè)。2009年，Cheng等[17]將莖環(huán)法 RT-qPCR成功地應(yīng)用于人工合成siRNA的檢測(cè)，并在分子、細(xì)胞和動(dòng)物個(gè)體等水平準(zhǔn)確定量了未修飾的單鏈siRNA，3末端有兩個(gè)突出的雙鏈Silencer?siRNA及LNA修飾的雙鏈Silencer?Select siRNA等3種形式的siRNA，有效地解決了對(duì)siRNA傳遞效率、分布和穩(wěn)定性等難于評(píng)價(jià)的問(wèn)題。

在本研究中，我們建立了檢測(cè)siN1和siN2兩個(gè)抗CSFV的特異siRNA表達(dá)水平的莖環(huán)法RT-qPCR，準(zhǔn)確定量檢測(cè)了抗CSFV的PK-15細(xì)胞克隆的siRNA表達(dá)水平，特異性強(qiáng)，靈敏度高，可精確至100個(gè)拷貝，檢測(cè)范圍寬?？捎糜赗NAi抗病毒效果的定量評(píng)價(jià)，為未來(lái)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的抗病毒效果評(píng)價(jià)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞

高效且特異抑制CSFV復(fù)制增殖的siRNA表達(dá)載體pLox-siN1和pLox-siN2及表達(dá)亂序siN1的對(duì)照載體pLox-siC均為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[6]；PK-15豬腎傳代細(xì)胞系 (85代) 由本室保存；豬胚胎成纖維細(xì)胞 (Porcine fetal fibroblasts，PFF) 由吉林大學(xué)歐陽(yáng)紅生教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶Apal Ⅰ購(gòu)自NEB公司；轉(zhuǎn)染試劑FuGENE?HD購(gòu)自Roche公司；G418購(gòu)自Gibco公司；總 RNA 提取試劑盒 (MirVana miRNA Isolation Kit)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit) 和實(shí)時(shí)定量PCR試劑 (TaqMan Universal Master Mix，No AmpErase?UNG) 均購(gòu)自 ABI公司；豬抗CSFV陽(yáng)性血清 (5號(hào)) 和陰性豬血清由本實(shí)驗(yàn)室制備、鑒定并保存[18]；異硫氰酸熒光素(FITC) 標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體購(gòu)自Sigma公司；實(shí)時(shí)定量 PCR儀 Stratagene Mx3000P購(gòu)自Agilent公司；核酸測(cè)定儀 NanoDrop 1000購(gòu)自Thermo公司。

1.2 轉(zhuǎn)染及抗CSFV的陽(yáng)性細(xì)胞克隆鑒定

用Apal Ⅰ雙酶切質(zhì)粒pLox-siN1、pLox-siN2和pLox-siC并乙醇沉淀回收含抗性基因neo的目的片段。用含10%小牛血清的MEM營(yíng)養(yǎng)液以每孔2.0×105個(gè)PK-15細(xì)胞傳代于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20~24 h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)滿度達(dá)到85%~90%，用FuGENE?HD轉(zhuǎn)染24 h后1∶50傳代于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后換用500 mg/L G418的MEM培養(yǎng)基篩選 12~14 d，質(zhì)粒 pLox-siN1、pLox-siN2和pLox-siC挑取細(xì)胞克隆 (分別命名為 PK-N1、PK-N2和PK-siC) 各3個(gè)至24孔板中培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行neo基因PCR鑒定 (引物neo-FP和neo-RP序列見(jiàn)表1)，以確定基因組中整合了目的基因片段。按以前所述方法[6]包括IFA (接毒后72 h)、病毒基因組拷貝數(shù) (48 h和72 h) 和TCID50(48 h和 72 h) 測(cè)定以上陽(yáng)性克隆抑制CSFV復(fù)制增殖的效果。

1.3 引物和MGB探針設(shè)計(jì)

參考 Chen等[16]和 Tang等[19]設(shè)計(jì) siN1和siN2檢測(cè)用引物和探針 (表 1)：莖環(huán)引物由 5′端通用莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列 (5′-CTCAACTGGTGTC GTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3′) 和3′端與siRNA 3′端反向互補(bǔ)配對(duì)的siRNA特異性序列組成，根據(jù)與siRNA配對(duì)的寡核苷酸數(shù)量 (6或8個(gè)) 不同對(duì)每個(gè)siRNA設(shè)計(jì)了兩種莖環(huán)引物(分別為 SLP-N1-6、SLP-N1-8和 SLP-N2-6、 SLP-N2-8)。實(shí)時(shí)定量PCR上游引物包括用于提高 Tm值并延伸 PCR產(chǎn)物的 5′端通用序列(5′-ACACTCCAGCTGGG-3′) 和3′端siRNA特異序列。MGB探針由5′端6-FAM標(biāo)記的通用序列 (5′-TTCAGTTGAG-3′) 和 3′端 MGB標(biāo)記siRNA特異序列組成。選擇表達(dá)豐度較高且穩(wěn)定的豬內(nèi)源性ssc-miR16為內(nèi)參，監(jiān)測(cè)樣本質(zhì)量、RNA提取及 RT-PCR等過(guò)程。所用引物均由南京金斯瑞基因有限公司合成，MGB探針由上?；祷蛴邢薰竞铣?，標(biāo)準(zhǔn)品ssiN1 (人工合成的siN1，序列見(jiàn)表1) 由TaKaRa公司合成。

1.4 莖環(huán)法RT-qPCR

1.4.1 總RNA提取

將獲取的抗CSFV的PK-15細(xì)胞克隆培養(yǎng)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)滿度達(dá)90%至95%時(shí)，棄培養(yǎng)液，用1 mL冷PBS在冰上洗細(xì)胞2次，然后按MirVana miRNA isolation kit說(shuō)明書(shū)建議加入 500 μL裂解液裂解后提取總 RNA，以正常PK-15細(xì)胞為陰性對(duì)照。用NanoDrop 1000測(cè)定RNA濃度及質(zhì)量，分裝于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 siRNA及引物和MGB探針序列Table 1 Sequence of siRNA, primer and MGB probe

1.4.2 莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括50 nmol/L莖環(huán)引物，0.25 mmol/L dNTPs，3.33 U/μL逆轉(zhuǎn)錄酶，0.25 U/μL RNA酶抑制劑，1倍逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10 ng總RNA，用無(wú)RNA酶水補(bǔ)至15 μL。反應(yīng)條件為冰上放置5 min，16 ℃ 30 min ，42 ℃延伸30 min，85 ℃酶滅活5 min，4 ℃保存。所有逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)均為兩個(gè)重復(fù)。

1.4.3 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系為10 μL PCR預(yù)混液，1.5 μmol/L上游引物，0.7 μmol/L通用下游引物，0.2 μmol/L MGB探針，1.2 μL cDNA產(chǎn)物，去離子水補(bǔ)至 20 μL。在 Agilent Stratagene Mx3000P實(shí)時(shí)定量PCR儀上完成反應(yīng)，條件為：95 ℃熱啟動(dòng)10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，在60 ℃收集熒光，共40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)包括陰性細(xì)胞對(duì)照 (NC) 和空白對(duì)照(NTC) 均為2個(gè)重復(fù)，結(jié)果取均值，產(chǎn)物連接T載體測(cè)序驗(yàn)證。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及靈敏度分析

為準(zhǔn)確定量細(xì)胞克隆的siRNA表達(dá)水平，以10 mg/L濃度的PK-15細(xì)胞總RNA為稀釋液10倍梯度稀釋已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品ssiN1，取8個(gè)梯度 (拷貝數(shù)從 10到 1.0×108) 進(jìn)行莖環(huán)法RT-qPCR檢測(cè)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞表達(dá)的siRNA拷貝數(shù)，并分析此方法檢測(cè)靈敏度。

1.4.5 特異性分析

因細(xì)胞表達(dá)數(shù)百種與siRNA大小相似的內(nèi)源性 miRNA，可作為特異性分析材料，所以選擇PK-N1、PK-N2和 PK-siC細(xì)胞克隆及陰性細(xì)胞PK-15和PFF的總RNA為模板進(jìn)行siN1和siN2的莖環(huán)法RT-qPCR檢測(cè)，以評(píng)價(jià)檢測(cè)特異性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Agilent公司的Stratagene Mx3000P軟件分析 PCR結(jié)果。采取手動(dòng)方式將閾值選定在固定熒光閾值 6000得到各反應(yīng)管的 Cq值(Quantification cycle)，軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。用SPSS軟件完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 抗CSFV PK-15細(xì)胞克隆的制備及鑒定

將 G418篩選獲得的 PK-15細(xì)胞克隆進(jìn)行neo基因PCR鑒定，均成功擴(kuò)增出了neo基因片段 (圖略)，說(shuō)明細(xì)胞克隆均整合了目的基因片段；抗CSFV檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，IFA結(jié)果中陽(yáng)性細(xì)胞克隆熒光比例為5%左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照細(xì)胞 PK-siC的 80%~85%，表明有效降低了CSFV抗原的合成；陽(yáng)性細(xì)胞克隆的病毒基因組拷貝數(shù)和 TCID50測(cè)定結(jié)果均顯著低于對(duì)照細(xì)胞(P<0.01)，表明有效抑制了病毒基因組復(fù)制和成熟病毒粒子裝配。以上結(jié)果共同表明已成功獲得了抗CSFV的PK-N1和PK-N2細(xì)胞克隆。

2.2 莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物篩選

應(yīng)用兩種莖環(huán)引物分別以相應(yīng)陽(yáng)性克隆、PK-15細(xì)胞的總 RNA 為模板進(jìn)行莖環(huán)法RT-qPCR檢測(cè)。為篩選出最佳莖環(huán)引物，以具有較高逆轉(zhuǎn)錄效率且較低的背景信號(hào)為篩選原則，并引入 ΔCq進(jìn)行量化評(píng)價(jià)，每種逆轉(zhuǎn)錄引物的ΔCq=Cq(陰性細(xì)胞對(duì)照) –Cq(陽(yáng)性細(xì)胞克隆)，ΔCq越大，則逆轉(zhuǎn)錄引物具有越高的逆轉(zhuǎn)錄效率且產(chǎn)生越低的背景信號(hào)。結(jié)果如圖2所示，siN1檢測(cè)體系的莖環(huán)引物SLP-N1-6的ΔCq(7.09) 遠(yuǎn)大于SLP-N1-8 (0.32)，siN2檢測(cè)體系的SLP-N2-8的ΔCq(10.48) 遠(yuǎn)大于SLP-N2-6 (5.93)，所以均為最佳的莖環(huán)引物。

2.3 特異性分析

特異性分析結(jié)果如表 2所示，PK-N1和PK-15的siN2檢測(cè)結(jié)果相同，PK-N2和PK-15的siN1檢測(cè)結(jié)果也相同，說(shuō)明siN1和siN2兩種檢測(cè)體系不會(huì)相互影響，均只能特異性地檢測(cè)各自目的siRNA；PK-siC和PK-15的siN1檢測(cè)結(jié)果相同，說(shuō)明亂序的siN1分子不會(huì)影響siN1的檢測(cè)；而兩種陰性細(xì)胞PK-15和PFF的Cq均在35左右，且遠(yuǎn)大于陽(yáng)性克隆 (Cq為25-28)，說(shuō)明檢測(cè)背景底，可通過(guò) Cq的差異有效地區(qū)分陰陽(yáng)性結(jié)果。以上結(jié)果共同表明我們建立檢測(cè) siN1和siN2的莖環(huán)法RT-qPCR受內(nèi)源性miRNA的干擾很小，具有很高的檢測(cè)特異性。

圖1 抗CSFV PK-15細(xì)胞克隆鑒定Fig. 1 Identity results of anti-CSFV cell clones. (A) IFA results of PK-15 cell clones at 72 h after CSFV infection (40×). Mock transfection: stained with CSFV-negative serum. (B,C) Quantity of CSFV genomic RNAs and infectious CSFV production at 48 h and 72 h after CSFV infection. PK-siC: PK-15 cell clones expressing scrambled siN1. ** P<0.01, very signifcant difference with PK-siC control.

圖2 莖環(huán)引物的篩選結(jié)果Fig. 2 Results of screening stem-loop primers. (A) 1, 3: PK-N1 RNA reverse transcribed with SLP-N1-8 (Cq=25.71) and SLP-N1-6 (Cq=28.14); 2, 4: PK-15 with SLP-N1-8 (Cq=26.03) and SLP-N1-6 (Cq=35.23). (B) 5, 6: PK-N2 RNA reverse transcribed with SLP-N2-8 (Cq=25.97) and SLP-N2-6 (Cq=31.82); 7, 8: PK-15 with SLP-N2-8 (Cq=36.45) and SLP-N2-6 (Cq=37.75).

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及靈敏度分析

以ssiN1為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3所示，1~7個(gè)梯度有很高的重復(fù)性，并能與陰性對(duì)照相區(qū)分，能檢測(cè)100個(gè)拷貝的siRNA；檢測(cè)線性范圍寬，可達(dá) 7個(gè)數(shù)量級(jí)；平行性好(Rsq=0.999)，擴(kuò)增效率高 (Eff.=98.2%)；可對(duì)目的siRNA進(jìn)行定量分析。

2.5 PK-N1和PK-N2細(xì)胞克隆的siRNA定量檢測(cè)

以經(jīng)抗CSFV鑒定的PK-N1和PK-N2細(xì)胞克隆各3個(gè)進(jìn)行siRNA定量檢測(cè)，用2-ΔCq法計(jì)算目的 siRNA相對(duì)于內(nèi)參 ssc-miR16的表達(dá)水平，如表2所示，結(jié)果表明陽(yáng)性細(xì)胞克隆PK-N1和PK-N2均表達(dá)了目的siRNA，但每個(gè)克隆的siRNA表達(dá)水平不同，最高為內(nèi)參ssc-miR16的 5.54倍，最低的為0.62倍，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其拷貝數(shù)在 1.0×104左右。產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定正確，表明成功建立了可準(zhǔn)確定量檢測(cè)siN1和siN2的莖環(huán)法RT-qPCR。

圖3 ssiN1檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍及靈敏度分析Fig. 3 Dynamic range and sensitivity of the ssiN1 assay. (A) Amplification plot of ssiN1 over eight orders of magnitude. 1-8: ssiN1 input ranged from 10 to 1.0×108 copies; NC: negative control; NTC: no template control. (B) Standard curve of the ssiN1.

表2 陽(yáng)性細(xì)胞克隆檢測(cè)及特異性分析結(jié)果Table 2 Results of positive cell clones and specificity analysis

3 討論

目前，RNAi已廣泛地應(yīng)用于抗病毒治療研究，一般通過(guò)測(cè)定細(xì)胞接毒后病毒基因組拷貝數(shù)(Real time RT-PCR) 和蛋白表達(dá)水平 (IFA) 及成熟病毒粒子裝配水平 (TCID50)[4,6]來(lái)評(píng)價(jià)抗病毒效果，但在某些情況下定量檢測(cè)siRNA的表達(dá)水平是非常必要的。我們?cè)鵀榇_定siRNA四表達(dá)載體是否表達(dá)了每種siRNA而按ter Brake等[1]的方法構(gòu)建了siRNA靶基因和報(bào)告基因GFP融合表達(dá)的報(bào)告質(zhì)粒，與siRNA表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)判斷siRNA是否表達(dá)及其抑制效果[6]。但這種間接的方法應(yīng)用范圍窄，僅能評(píng)價(jià)siRNA載體的有效性，所以需要建立一種直接檢測(cè)siRNA的方法，以滿足廣泛的需要。

目前已有多種可用于檢測(cè)siRNA的方法，而選擇最適的方法是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。熒光定量PCR是基因表達(dá)定量分析的金標(biāo)準(zhǔn)，盡管siRNA的短小對(duì)其提出了巨大挑戰(zhàn)，但仍有多種實(shí)時(shí)定量方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)[9-16]，這些方法兼具了實(shí)時(shí)定量 PCR的高靈敏度、高特異性、準(zhǔn)確定量及寬動(dòng)態(tài)范圍的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。而莖環(huán)法RT-qPCR因創(chuàng)新地設(shè)計(jì)了莖環(huán)引物，其莖部的堿基堆積作用大大增加了RNA-DNA雜交雙鏈的熱穩(wěn)定性，另外，莖環(huán)的空間限制作用使之比常規(guī)線性引物有更高的特異性，并聯(lián)合特異性MGB探針，使其成為準(zhǔn)確定量siRNA的最佳選擇。

在莖環(huán)引物的篩選過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于siN1檢測(cè)體系 (圖2A)，用SLP-N1-8逆轉(zhuǎn)錄陽(yáng)性細(xì)胞 (25.71) 和陰性細(xì)胞對(duì)照 (26.03) 的 Cq值基本相同，可能是體系中上游引物與莖環(huán)引物產(chǎn)生雜交反應(yīng)，產(chǎn)生很高的假陽(yáng)性信號(hào)，是不合格的引物；而 SLP-N2-6有較低的背景信號(hào)(35.23)，可有效區(qū)分陰陽(yáng)性結(jié)果，是較理想的逆轉(zhuǎn)錄引物。對(duì)于 siN2檢測(cè)體系 (圖 2B)，無(wú)論SLP-N2-6 還是 SLP-N2-8的陰性細(xì)胞對(duì)照均有較低的背景信號(hào)，但 SLP-N2-8的陽(yáng)性細(xì)胞(25.97) 的Cq遠(yuǎn)小于SLP-N2-6 (31.82)，而這種信號(hào)不可能來(lái)自于較低的背景信號(hào)，所以說(shuō)明SLP-N2-8有更高的逆轉(zhuǎn)錄效率，為較佳的逆轉(zhuǎn)錄引物。根據(jù)以上研究結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)莖環(huán)引物的3′端與siRNA配對(duì)的堿基個(gè)數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)成敗至關(guān)重要，配對(duì)8個(gè)可能會(huì)與上游引物重疊導(dǎo)致雜交反應(yīng)，造成假陽(yáng)性結(jié)果，而配對(duì)6個(gè)又可能會(huì)降低逆轉(zhuǎn)錄效率，所以本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)兩種莖環(huán)引物，以實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選效果最佳者，并引入ΔCq來(lái)進(jìn)行量化評(píng)價(jià)，結(jié)果選擇了SLP-N1-6和SLP-N2-8為最佳莖環(huán)引物。

因?yàn)?siRNA和 miRNA均為21 nt左右的RNA分子，所以siRNA的檢測(cè)一般會(huì)受到細(xì)胞內(nèi)源性數(shù)百種且表達(dá)量較高的miRNA的干擾。我們?cè)肧hi等[15]的Poly (A) 加尾法RT-qPCR檢測(cè)目的siRNA，但其陰性細(xì)胞對(duì)照及水對(duì)照均有擴(kuò)增曲線 (數(shù)據(jù)未顯示)，可能是受miRNA的干擾所致，再加上引物二聚體與擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線 Tm大小相近，給陰陽(yáng)性結(jié)果的分析判斷帶來(lái)極大困難。而 Cheng等[17]報(bào)道了莖環(huán)法RT-qPCR也會(huì)產(chǎn)生非特異性曲線，他們?cè)O(shè)計(jì)的107個(gè)siRNA檢測(cè)體系，在以HeLa細(xì)胞RNA為陰性對(duì)照時(shí)，絕大多數(shù)體系 (101個(gè)) Cq值大于35，有5個(gè)Cq值在30至35之間，1個(gè)Cq值小于30，而陽(yáng)性結(jié)果均小于 30，所以陰性細(xì)胞對(duì)照的Cq值大于35可說(shuō)明體系有較低的非特異性擴(kuò)增反應(yīng)，不會(huì)影響目的siRNA的檢測(cè)。為了探明細(xì)胞內(nèi)數(shù)百種 miRNA對(duì)我們所建立的siN1siN2檢測(cè)體系的影響，選擇了具有獨(dú)特miRNAs表達(dá)譜系的 PK-15和 PFF兩種陰性細(xì)胞，結(jié)果PK-15細(xì)胞 (見(jiàn)表2) 的Cq值均大于35，而PFF細(xì)胞的Cq值均在33到35之間，說(shuō)明了細(xì)胞的miRNAs表達(dá)譜系會(huì)對(duì)檢測(cè)有所影響，但這種影響又是微乎其微的 (兩種陰性細(xì)胞僅相差1到2個(gè)Cq，而與陽(yáng)性細(xì)胞相差7到10個(gè)Cq)，綜上結(jié)果表明，我們所建立的檢測(cè)siN1和siN2的莖環(huán)法RT-qPCR均有很高的檢測(cè)特異性。

為了準(zhǔn)確定量細(xì)胞siRNA的表達(dá)水平，曾應(yīng)用Promega公司的 Riboprobe System-T7系統(tǒng)體外轉(zhuǎn)錄的 siN1分子為標(biāo)準(zhǔn)品，但因無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定siN1拷貝數(shù)而選擇了ssiN1，并用10 mg/L的正常PK-15細(xì)胞總RNA為稀釋液進(jìn)行10倍梯度稀釋，模擬細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)環(huán)境，充分考慮了細(xì)胞內(nèi)源性miRNA的干擾，以達(dá)到準(zhǔn)確定量siRNA的目的。

雖然篩選獲得的抗CSFV細(xì)胞克隆均表達(dá)了目的 siRNA，但每個(gè)克隆的siRNA表達(dá)水平顯著不同，這可能是由于外源基因隨機(jī)地整合到受體細(xì)胞染色體的任意位置，產(chǎn)生了位置效應(yīng)，也可能是隨機(jī)整合了多個(gè)外源基因所致。

本研究建立的莖環(huán)法RT-qPCR，可用于準(zhǔn)確定量檢測(cè)細(xì)胞抗病毒 siRNA的表達(dá)水平，聯(lián)合IFA等檢測(cè)病毒水平的方法定量評(píng)價(jià)RNAi抗病毒的有效性。在抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建過(guò)程中，此方法可用于篩選siRNA高效表達(dá)的供體細(xì)胞克隆，從而提高抗病毒轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率，并可應(yīng)用于未來(lái)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的抗病毒效果的評(píng)價(jià)。另外，本方法對(duì)siRNA、miRNA等小RNA的檢測(cè)工作具有很好的參考價(jià)值。

REFERENCES

[1] ter Brake O, 't Hooft K, Liu YP, et al. Lentiviral vector design for multiple shRNA expression and durable HIV-1 inhibition. Mol Ther, 2008, 16(3): 557?564.

[2] Wu CJ, Huang HW, Liu CY, et al. Inhibition of SARS-CoV replication by siRNA. Antiviral Res, 2005, 65(1): 45?48.

[3] Ruggli N, Bird BH, Liu LZ, et al. Nproof classical swine fever virus is an antagonist of double-stranded RNA-mediated apoptosis and IFN-α/β induction. Virology, 2005, 340(2): 265?276.

[4] Xu XR, Guo HC, Xiao C, et al. In vitro inhibition of classical swine fever virus replication by siRNAs targeting Nproand NS5B genes. Antiviral Res, 2008, 78(3): 188?193.

[5] Li JN, Guo HC, Shi ZX, et al. In vitro inhibition of CSFV replication by retroviral vector-mediated RNA interference. J Virol Methods, 2010, 169(2): 316?321.

[6] Li JN, Dai YJ, Liu S, et al. In vitro inhibition of CSFV replication by multiple siRNA expression. Antiviral Res, 2011, 91(2):209?216.

[7] Pall GS, Codony-Servat C, Byrne J, et al. Carbodiimide-mediated cross-linking of RNA to nylon membranes improves the detection of siRNA, miRNA and piRNA by Northern blot. Nucleic Acids Res, 2007, 35(8): e60.

[8] Várallyay é, Burgyán J, Havelda Z. Detection of microRNAs by Northern blot analyses using LNA probes. Methods, 2007, 43(2): 140?145.

[9] Jiang M, Arzumanov AA, Gait MJ, et al. A bi-functional siRNA construct induces RNA interference and also primes PCR amplification for its own quantification. Nucleic Acids Res, 2005, 33(18): e151.

[10] Raymond CK, Roberts BS, Garrett-Engele P, et al. Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA, 2005, 11(11): 1737?1744.

[11] Ro S, Park C, Jin JL, et al. A PCR-based method for detection and quantification of small RNAs. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 351(3): 756?763.

[12] Varkonyi-Gasic E, Wu R, Wood M, et al. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods, 2007, 3: 12.

[13] Sharbati-Tehrani S, Kutz-Lohroff B, Bergbauer R, et al. miR-Q: a novel quantitative RT-PCR approach for the expression profiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complex sample. BMC Mol Biol, 2008, 9(1): 34.

[14] Stratford S, Stec S, Jadhav V, et al. Examination of real-time polymerase chain reaction methods for the detection and quantification of modified siRNA. Anal Biochem, 2008, 379(1): 96?104.

[15] Shi R, Chiang VL. Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR. Biotechniques, 2005, 39(4): 519?525.

[16] Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res, 2005, 33(20): e179.

[17] Cheng AG, Li M, Liang Y, et al. Stem-loop RT-PCR quantification of siRNAs in vitro and in vivo. Oligonucleotides, 2009, 19(2): 203?208.

[18] Yu XH, Tu CC, Lu HW, et al. DNA-mediated protection against classical swine fever virus. Vaccine, 2001, 19(11/12):1520?1525.

[19] Tang FC, Hajkova P, Barton SC, et al. MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells. Nucleic Acids Res, 2006, 34(2): e9.