低分子量肝素的研究進展

楊明康，李曉燕，錢 捷，黃 磊，蔡 謹，徐志南

(1.浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州310014;2.浙江大學化學工程與生物工程系生物工程研究所，浙江杭州310027)

肝素(heparin)是一種葡糖胺聚糖，它廣泛存在于動物器官和組織(如小腸黏膜、肺等)中，具有抗凝、抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌、調(diào)血脂等多種生物學功能，但長期使用會出現(xiàn)出血和誘導血小板減少等負面影響。低分子量肝素(low molecular weight heparin，LMWH)是20世紀80年代開發(fā)出來的新一代肝素類抗凝藥物，它是由普通肝素(亦稱未分級肝素un－fractionated heparin，UFH)解聚而得。其分子量較低，一般為4 000～7 000。臨床上主要用于預防深靜脈血栓，治療不穩(wěn)定心絞痛和心肌梗死，還可用于血液體外循環(huán)和血液透析等。與UFH相比LMWH具有口服易吸收、皮下注射吸收好、生物利用度高、體內(nèi)半衰期長、出血傾向小等特點，在歐洲及北美對LMWH的應(yīng)用大有取代UFH之勢［1］。本文介紹了LMWH的化學結(jié)構(gòu)、作用機制及其應(yīng)用，并對LMWH制備方法的研究進展進行了綜述。

1 LMWH的結(jié)構(gòu)及作用機理

UFH是由六糖或八糖重復單位構(gòu)成的一簇酸性粘多糖混合物，成線形鏈狀，分子量約3～37 kDa，平均分子量15 kDa，抗Xa因子與抗IIa因子活性比大于1.5。而LMWH則是由UFH通過控制的酶解或化學降解或經(jīng)分級分離所產(chǎn)生的片段。英國藥典規(guī)定［2］LMWH的重均分子量一般不得大于8 000，且其中分子量小于8 000的物質(zhì)至少應(yīng)超過60%。LMWH的主體結(jié)構(gòu)與UFH相似，都是由D－葡糖胺與葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸交替殘基糖鏈組成，但其末端結(jié)構(gòu)存在著較大的不同，LMWH結(jié)構(gòu)如圖1所示:

圖1 低分子肝素的結(jié)構(gòu)

UFH和LMWH通過激活抗凝血酶功能而起到抗凝血作用，抗凝血酶功能的激活由沿UFH鏈分布的獨特五糖序列所介導，該五糖序列在UFH鏈上約占1/3，在LMWH鏈上僅占1/5左右。五糖單位與抗凝血酶結(jié)合改變了酶的構(gòu)象，致使肝素對凝血酶(FIIa)及其活化X因子(FXa)的抑制作用增大了約1 000倍。UFH與LMWH的主要差別在于其對FIIa和FXa的相對抑制作用不同。LMWH鏈能直接與抗凝血酶結(jié)合，改變抗凝血酶的構(gòu)象，進而抑制FX的活性;而UFH必須與凝血酶及抗凝血酶同時結(jié)合，形成三聯(lián)體復合物后才能起效，且該復合物的組成較為復雜，需同時含有18個以上的糖基和五糖單元的肝素鏈才能組成。大多數(shù)UFH鏈的長度至少有18個糖基，而LMWH的鏈長只有抗凝血酶及凝血酶兩者結(jié)合時長度的50%。因此UFH的抗FXa與抗FIIa的活性大致相當，而LMWH的抗FXa活性則明顯高于其抗FIIa活性［3～5］，抗FXa與抗FIIa活性對UFH和LMWH的抗血栓形成作用都是必需的。

2 LMWH的制備方法

LMWH的制備方法包括:物理分離法、化學降解法和合成法。不同制備方法所得LMWH在分子量和生物活性上存在差異，表現(xiàn)為其藥動學特性和抗凝譜有某種程度的差別，在臨床上不能相互代替［6］。表1列舉了EP7.0和BP2010收載的5種目前臨床上使用的LMWH［7］。

表1 EP7.0和BP2010收載的五種LMWH的比較

2.1 物理分離法 物理分離法主要包括有機溶劑沉淀法、超濾法和層析法等。物理分離法只是一種簡單的分離過濾方法，由于UFH中低分子片段含量很少(1%～2%)，因此該法制備的LMWH產(chǎn)率較低，不宜大規(guī)模生產(chǎn)。但其對UFH原有結(jié)構(gòu)破壞較少，具有保留較高生物活性的優(yōu)點，常用于結(jié)構(gòu)測定及生物活性的研究。

2.1.1 有機溶劑沉淀法 不同分子量的肝素分子在有機溶劑中的溶解度不同，在同一濃度的有機溶劑中，隨著分子量的增大，其溶解度逐漸減小。在低濃度甲醇、乙醇、異丙醇中，UFH大分子不溶解，而較小的LMWH分子溶解度大。使得LMWH隨著有機溶劑濃度的增大而沉淀出來，從而分離出LMWH。Lormeau等［8］利用乙醇沉淀UFH，得到平均分子量6 500 D的LMWH，其抗凝效價45 U·mg－1，抗FXa效價為160 U·mg－1，但收率僅有2%。

2.1.2 超濾法 超濾法是采用一定規(guī)格的超濾膜進行過濾分離LMWH的方法，因UFH與LMWH分子量有較大差異，因此當大分子量的UFH通過超濾膜時分子被截留，而小分子量的LMWH則可以順利通過超濾膜，從而達到分離純化LMWH的目的。

2.1.3 層析法 層析法包括凝膠過濾層析法、親和層析法和離子交換層析法等。凝膠過濾層析法是一種根據(jù)分子篩效應(yīng)來分離不同分子量大小的LMWH的方法，常用的葡聚糖凝膠有Sephadex G－75，該法常配合其他方法使用［9］。親和層析法是利用共價鍵連接有特異配體的層析介質(zhì)，將能特異結(jié)合配體的LMWH進行分離的技術(shù)，因其分離純化都是基于標簽進行，后續(xù)步驟中對標簽的處理問題常成為安全顧慮，因而較少用于工業(yè)化生產(chǎn)。離子交換層析法則是通過DEAE－纖維素等陰離子交換劑與UFH上的負電荷離子根據(jù)交換時的結(jié)合力大小不同而將LMWH從中分離出來。

2.2 化學降解法 化學裂解法生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，產(chǎn)品質(zhì)量易于控制，常用于工業(yè)化生產(chǎn)。主要有亞硝酸控制解聚降解法、過氧化氫降解法、β－消除降解法和肝素酶降解法等。使用不同的降解方法所得產(chǎn)品的末端結(jié)構(gòu)不同，導致其生物活性也不盡相同。不同降解法制得LMWH的優(yōu)缺點見表2。

表2 不同化學降解法優(yōu)缺點比較

2.2.1 亞硝酸控制解聚降解法 亞硝酸降解法工藝流程簡單，是工廠較為常用的一種生產(chǎn)LMWH的方法。在低pH值的條件下，亞硝酸先作用于UFH分子中的N－硫酸葡糖胺單位，脫去HSO4－形成－NH2。－NH2與HNO2發(fā)生重氮化反應(yīng)，在放氮同時糖苷鍵斷裂，電子轉(zhuǎn)移，縮環(huán)生成2，5－脫氫甘露糖或脫氫甘露醇。

該解聚過程受溫度、pH值、亞硝酸鹽的濃度及降解時間的影響較大。LMWH的分子量可由亞硝酸用量、反應(yīng)時間來檢測并控制。亞硝酸在反應(yīng)液中的濃度越大，產(chǎn)物LMWH的平均分子量越小。亞硝酸濃度過低時解聚不夠充分，濃度過高時又會導致UFH在不適宜的位置斷裂，使結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。有研究表明［10］亞硝酸用量可在0.01% ～1.0%范圍內(nèi)調(diào)整效果較好，殘留亞硝酸鹽亦可通過超濾或紫外照射脫除［11］。張麗萍等［12］以UFH為原料，通過單因素試驗與二次旋轉(zhuǎn)回歸組合試驗，研究了亞硝酸降解法制備LMWH的最佳條件，結(jié)果在反應(yīng)時間4 h，溫度25℃，左右亞硝酸濃度0.6%，pH 2.6時，得到相對分子質(zhì)量小于8 000的成分含量為89.95%。

2.2.2 過氧化氫降解法 過氧化氫產(chǎn)生的氧自由基能使UFH分子中非硫酸化糖醛酸的C2和C3之間發(fā)生鍵斷裂，進而形成LMWH［13］。反應(yīng)的溫度、pH值和過氧化氫濃度對該法制備LMWH的影響較大。在酸性范圍時，產(chǎn)物的分子量隨著溶液pH值的增大而降低;但當pH值大于8時，產(chǎn)物的分子量則明顯增大，因此在反應(yīng)的過程中應(yīng)不斷加入鹽酸以使反應(yīng)液的pH值始終維持在5～7。

有報導［14］稱可以用抗壞血酸、硫酸銅和3%的過氧化氫對UFH進行降解，但制得的產(chǎn)品中殘留銅離子。將乙酸銅替代硫酸銅，并在沉淀之前利用EDTA來絡(luò)合銅離子，進一步用陽離子交換樹脂可較好的除去產(chǎn)品中的銅離子［15］。研究表明［16］采用強陽離子樹脂酸化處理UFH，再加入過氧化氫，可以生成硫酸化程度較高的LMWH。此外劉東［17］研究了將過氧化氫降解與親和色譜相結(jié)合的方法來制備LMWH，所得的產(chǎn)品抗Xa效價達到了585 IU·mg－1，是目前市場上現(xiàn)有LMWH產(chǎn)品抗Xa效價的4倍以上。

2.2.3 β－消除降解法 β－消除降解法分為肝素的直接處理和肝素季銨鹽的堿處理兩部分。肝素中糖醛酸的酯化能夠增強α－H原子的酸度，使得在水相或非水相介質(zhì)當中更易于與親和基團發(fā)生β－消去反應(yīng)。肝素的季銨鹽與烷基鹵在有機溶劑中發(fā)生酯化反應(yīng)，生成的肝素酯在堿性條件下進一步水解成LMWH。肝素的季銨鹽在氯苯和堿存在下加熱反應(yīng)，生成肝素的芐酯能形成4，5未飽和的糖醛酸［18］。堿水解的反應(yīng)條件，如反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、堿的濃度等對該法制得LMWH的平均分子量影響較大。

2.2.4 其他制備LMWH的化學降解法 其他制備LMWH的化學方法還有高碘酸降解、次氯酸降解、γ－照射和硫酸－氯磺酸降解等。其中前三種方法其制備機理和過氧化氫降解的制備機理相似，都是通過產(chǎn)生的氧自由基斷裂肝素中非硫酸化糖醛酸的C2和C3之間的鍵，進而生成LMWH。

Lormeau等［19］利用高碘酸降解法制得分子量為4 800～9 000的LMWH，但其抗Xa活性較低。Diaz VB等［20］采用次氯酸降解法生產(chǎn)的LMWH，產(chǎn)品色澤較好且無重金屬污染。該法在一定條件下，產(chǎn)品的分子量與反應(yīng)時間之間有一定關(guān)系，產(chǎn)品分子量符合藥典規(guī)定時即可加入硫氫化鈉終止反應(yīng)。Jeske W等［21］曾用γ－照射法在實驗室制備出LMWH，但尚未見其工業(yè)化應(yīng)用。硫酸－氯磺酸降解法［22］降解機理為葡萄糖胺亞基6位上的羥基被硫酸酯化，使得葡糖胺3位上的羥基被硫酸化。該法制備的LMWH分子量為2 000～9 000，產(chǎn)品硫酸化程度比UFH至少高出20%。

2.3 酶法降解 肝素酶是一類能降解肝素類物質(zhì)的裂解酶，目前市售的肝素酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，都是來源于肝素黃桿菌。它們能特異性地斷裂肝素鏈上具有特殊修飾的不同序列，從而產(chǎn)生不同的寡糖片段［23］。肝素酶可斷裂己糖胺和糖醛酸之間的鍵，在非還原末端生成4，5－不飽和艾杜糖醛酸。而在還原末端230～235 nm處的吸收值又與降解產(chǎn)物中的肝素分子量有一定關(guān)系，因此可以通過測量230 nm處的吸收度來控制產(chǎn)品質(zhì)量［24］。

周帥等［25］將肝素黃桿菌固定化后制備LMWH，發(fā)現(xiàn)所制得的LMWH分子量較為均一，活性也較好。固定化酶和超濾聯(lián)用可控制產(chǎn)物的分子量，并實現(xiàn)生產(chǎn)的自動化。由于該制備LMWH過程中每次只降解1個雙糖單位，因此制得的產(chǎn)品可以作為測定LMWH的對照品使用。目前，商品肝素酶的唯一來源是肝素黃桿菌，其酶的作用方式是外切型，雖然用此肝素酶進行肝素降解在實驗室研究已經(jīng)成功，但在工業(yè)上用于肝素寡糖的制備還不成熟。

2.4 合成法 目前市售肝素類商品，無論物理分離法還是化學降解法制備所得，其原料藥都是來源于動物，存在原料藥受到污染的可能，因此對研制非動物來源的具有更高安全性能的肝素類藥品具有迫切需求。而合成法因為主要是通過基因工程的方法制備，所制得的肝素可以滿足醫(yī)藥界對于肝素的兩個基本要求，即化學和生物學等效于市面使用的動物來源的肝素，以及不含病毒、蛋白轉(zhuǎn)染因子以及化學污染品等。具有較高的安全性和結(jié)構(gòu)的確定性使得合成法研制肝素類似物將會是研究的趨勢。

2011年美國倫斯勒理工學院(RPI)的Linhart.J實驗室以及北卡羅來納大學教堂山分校(UNC)的劉健教授報道了一種化學酶法合成兩種結(jié)構(gòu)確定的超低分子量肝素化合物的方法［26，27］。合成過程模擬了肝素的生物合成途徑，多糖的骨架使用糖基轉(zhuǎn)移酶構(gòu)建，然后硫黃基轉(zhuǎn)移酶對特定的位點進行硫黃化修飾。以亞硝酸降解肝素前體所得的二糖為前體，在KfiA和pmHS2的分步加糖基作用下合成七糖，七糖經(jīng)過N－去三氟乙?；虲5異構(gòu)化將葡萄糖醛酸異構(gòu)化成艾杜葡萄糖醛酸，最后經(jīng)2－O－硫黃化、6－O－硫黃化以及3－O－硫黃化修飾后最終產(chǎn)物。這兩種超低分子量肝素化合物分別需要10步或12步酶反應(yīng)得到，其得率遠大于化學合成法，分別達到45%和37%。這兩種超低分子量肝素具有與Arixtra肝素相當?shù)目鼓钚砸约八幋鷦恿W特性。該法涉及多種基因和酶的克隆表達，步驟較復雜，目前尚未見到其正式應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的報道，但上述方法為合成肝素類似物提供了一種極具吸引力的新思路。

3 展望

LMWH是一類具有極大市場潛力的抗血栓藥物，其在國際醫(yī)藥市場的應(yīng)用已較成熟，但在國內(nèi)市場上LMWH的臨床應(yīng)用仍處于起步階段。隨著國內(nèi)對LMWH藥物認識程度的不斷深入，LMWH藥物的市場需求必將迅猛增長。我國是世界上產(chǎn)肝素最多的國家，所生產(chǎn)的肝素多以原料的形式用于出口，出口的肝素經(jīng)國外加工制成LMWH或類肝素等產(chǎn)品又返銷回國內(nèi)，這一模式雖為國家創(chuàng)收了外匯，但產(chǎn)品的附加值不高缺乏市場競爭力。因而探尋研制理想分子量及分子量分布的LMWH新方法，制備出符合國際市場標準的產(chǎn)品將具有廣闊的發(fā)展前景。

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