固相微萃取－氣相色譜－質譜法測定大頭金蠅樣本內氯氮平

李學博，莫耀南，周海梅，李 樸，馬錦琦，萬立華，王清山

（1.重慶醫(yī)科大學法醫(yī)學與生物醫(yī)學信息研究室，重慶 400016；2.河南科技大學法醫(yī)學院，河南 洛陽 471003；3.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶 401147）

在法醫(yī)學檢案過程中常遇到嚴重腐敗甚至白骨化的尸體，難以獲得合適的用于毒物分析的體液和組織樣本，此時嗜尸性昆蟲的幼蟲和蛹可以作為 可 靠 的 檢材[1－2]。1980 年 Beyer等[3]首次利用孳生在骸骨上的蛆蟲樣本成功檢測出了苯巴比妥藥物，隨后的研究表明多種藥（毒）物可以通過昆蟲樣本進行檢測，Kharbouche等[4]利用液相色譜－質譜聯用（LC/MS）技術從絲光綠蠅體內成功測定了可待因，Wood等[5]利用液相色譜－串聯質譜聯用（LC－MS/MS）技術從紅頭麗蠅幼蟲體內成功檢測了10種苯二氮卓類藥物，Gosselin等[6]利用高效液相色譜－串聯質譜（UPLC－MS/MS）方法成功檢測了絲光綠蠅幼蟲體內的美沙酮，Roeterdink等[7]利用電感耦合等離子體質譜（ICP－MS）技術分析了麗蠅幼蟲體內射擊殘留物成分，此外，也有利用氣相色譜－質譜（GC/MS）技術成功定量檢測蠅蛆體內苯丙胺類毒品及馬拉硫磷的報道[8－10]，現代化檢測儀器設備的使用使定量測定單個幼蟲及蛹樣本的藥（毒）物水平成為可能[5－6]，甚至羽化后的空蛹殼和排泄物也可以檢測到部分毒物成分[11－12]，即使在軟組織中不能檢測到的毒物，仍可以通過蠅類幼蟲測得[13]。更為有利的是，以昆蟲為檢材進行藥（毒）物分析時，分析儀器還不會受到尸體分解產物，如尸堿的影響[2，14－15]。

氯氮平（clozapine，CLP）是臨床最常用的抗精神病藥物之一，也是患者意外過量服用中毒死亡和自殺案件中常見的藥物。本研究通過建立固相微萃取氣相色譜－質譜聯用（SPME－GCMS）的檢測方法，對取食含有不同濃度CLP培養(yǎng)基質上的大頭金蠅幼蟲和蛹進行定量檢測，旨在為同類中毒死亡案件的分析檢驗提供相關借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

6890－5973N氣相色譜－質譜聯用儀：美國Agilent科技有限公司產品；NIST98色譜工作站；固相微萃取儀（SPME）及100μm聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取頭：美國Supelco公司產品。

氯氮平（clozapine，CLP）標準品：中國藥品生物制品檢定中心提供；洛沙平（loxapine）標準品：內標，中國藥品生物制品檢定中心提供；氯化鈉、氫氧化鈉、甲醇：均為分析純。

1.2 儀器條件及溶液配制

1.2.1 色譜－質譜條件 色譜柱：HP－5MS（30 m×0.25mm×0.25μm）彈性石英毛細管柱；柱流量1.0mL/min；柱溫設定：初溫160℃，以40℃/min升溫至260℃，再以5℃/min升溫至280℃；進樣口溫度：260℃；載氣：高純氦氣；進樣方式：不分流進樣；GC/MS接口溫度：280℃；EI源（70eV），電子倍增器電壓1 106V。

1.2.2 溶液配制 精密稱取CLP標準品5 mg，添加50mL甲醇溶解稀釋，得100mg/L CLP標準品儲備液，同法配制100mg/L洛沙平儲備液，置于4℃冰箱避光保存。精密量取CLP標準品儲備液，加甲醇分別配置成50、100、500、1 000、5 000、10 000、50 000μg/L濃度的標準工作液。同法配制1 500μg/L濃度的內標工作液。

1.3 大頭金蠅培養(yǎng)

供試大頭金蠅為野外捕獲，經鑒定種屬后在實驗室內連續(xù)培養(yǎng)獲得，在蠅籠內以紅糖、奶粉飼養(yǎng)，產卵高峰期以新鮮豬肝誘其產卵。取肝組織4份，400g/份，分別添加2mg、4mg及8mg的CLP水溶液后攪碎混勻并盛裝在500mL燒杯內，分別編號C1、C2、C3，同時設空白對照組C0組。將卵塊取出后按照400粒/份分別接種至以上含有不同濃度CLP的培養(yǎng)基上，將燒杯放至30cm×40cm×30cm的培養(yǎng)盒內，培養(yǎng)盒底層鋪有2cm消毒細沙，上口覆蓋固定細孔紗網。置于實驗溫度（25±0.2）℃，相對濕度（75±5）%，光周期L∶D＝14∶10下培養(yǎng)。參照文獻[4]方法，分別在大頭金蠅卵孵化后的52、76、100、124h及離食前期和后期取幼蟲各50只，待幼蟲化蛹后，取蛹樣本50只，將以上樣本置于－20℃冰箱凍死，保存?zhèn)錂z。

1.4 樣本處理與測定

取不同時期的大頭金蠅幼蟲及蛹的樣本，每次分析隨機取10只，稱重后按照參考文獻中的方法[4，16]，先后用去離子水反復沖洗，去除體表粘附的食物組織，用濾紙吸干體表殘留液體，在樣本中加入200μL內標工作液，添加甲醇4g勻漿，置于60℃水浴中加熱平衡10min，離心，取上清液2mL至4mL樣品瓶，加入1.0g NaCl飽和溶液，添加1mol/L NaOH調節(jié)pH為9，振蕩20s。再將樣品瓶置于40℃水浴中加熱平衡10min，然后將萃取頭浸入樣品萃取30min。取出萃取頭置于雙蒸水中振洗20s，然后置于50%甲醇中振洗10s，取出后揮干并插入GC/MS進樣口解析90s。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結果與討論

2.1 色譜質譜圖

取含有內標的CLP標準工作液，以掃描方式進樣及選擇離子（SIM）方式檢測，其總子流圖示于圖1。待CLP與內標完全分離，二者的保留時間分別為6.97min及10.01min，CLP選擇離子為：m/z 243、256、192、245，洛沙平選擇離子為：m/z257、83、70、193，如圖2、圖3所示，未見其他干擾成分。

圖1 GC/MS方式檢測樣本內的總離子色譜圖Fig.1 TIC of samples analyzed by GC/MS

2.2 檢測限與標準曲線

取孵化后100h的C0組大頭金蠅幼蟲10只/份，按照預處理方法洗凈后分別添加一定量的CLP，制作分別含有 CLP 5、10、50、100、500、1 000、5 000μg/L的樣品（均含內標500μg/L），以選擇離子方式進樣，測定CLP檢測限并計算信噪比，根據峰面積比對濃度比（CLP對內標）作線性回歸。結果顯示CLP的檢測限為0.1 μg/L（信噪比＞3），在5～5 000ng/mg范圍內線性良好，回歸方程為：y＝0.039 9x－0.607 3，r＝0.999 8（n＝7），示于圖4。

圖2 氯氮平的總離子質譜圖Fig.2 Toltal ion mass－spectrograms of CLP

圖3 洛沙平的總離子質譜圖Fig.3 Toltal ion mass－spectrograms of loxapine

圖4 氯氮平的標準工作曲線Fig.4 Standard curve of CLP

2.3 回收率與精密度

取孵化后100h的C0組大頭金蠅幼蟲10只/份，按照預處理方法洗凈后分別添加一定量的CLP，分別制作含有CLP 100、500、1 000μg/L樣品（均含內標500μg/L），按1.4樣品預處理步驟操作后分析測定，1日內重復分析測定5次，連續(xù)測定3日，按照上述回歸方程計算各濃度的相對回收率均值，并得日內及日間精密度均值，列于表1。

2.4 大頭金蠅樣品內CLP水平測定

按上述樣品處理方法及檢測條件，對生長在含有不同濃度CLP培養(yǎng)基質上的大頭金蠅不同時期的幼蟲和蛹進行分析測定，成功定量檢測出了樣品中的CLP。實驗用于檢測的樣本經去離子水和甲醇反復沖洗后，可去除體表食物成分中CLP對檢測的影響[17]，使結果更加準確。

表1 SPME－GC/MS法在大頭金蠅幼蟲樣本內的準確度及精密度Table 1 Accuracy and precision of clozapine from larvae of Chrysomya megacephala by SPME－GC/MS

檢測結果列于表2。由表2可看出，在取食期、離食期的幼蟲和蛹內均檢測到了CLP，其中76h、100h及124h的取食期幼蟲各實驗組樣本間CLP水平差異顯著（P＜0.05）。大頭金蠅樣本內CLP水平與取食時間有關，在幼蟲發(fā)育的早期CLP水平較低，隨著取食時間的延長而增長，與上一次檢測結果相比，取食76h和124 h的幼蟲變化顯著（P＜0.01），這可能與CLP在幼蟲體內不斷蓄積有關。在離食期CLP水平又大大降低（P＜0.01），這是由于此時CLP的排泄大于攝入所致，蛹期僅檢測到極微量的CLP，與相關研究報道一致[12，18]。通常情況下，由于受到代謝的影響，組織中的藥物濃度明顯高于昆蟲樣本[19]。

表2 不同時期的大頭金蠅幼蟲及蛹樣本CLP的濃度（μg/g，±s）Table 2 Concentration of CLP in samples of larvae and pupae in different time（μg/g，±s）

表2 不同時期的大頭金蠅幼蟲及蛹樣本CLP的濃度（μg/g，±s）Table 2 Concentration of CLP in samples of larvae and pupae in different time（μg/g，±s）

分組 幼蟲52h 幼蟲76h 幼蟲100h 幼蟲124h 離食前期幼蟲 離食后期幼蟲 蛹C1 1.9±0.33 2.38±0.81 3.23±1.22 4.27±1.23 2.02±0.67 1.24±0.37 0.09±0.02 C2 2.33±0.38 4.12±1.56 6.22±1.55 8.25±3.58 3.84±1.26 1.65±0.43 0.15±0.06 C3 3.28±0.65 6.56±2.34 9.61±2.67 12.33±4.224.55±1.85 1.88±0.76 0.18±0.05

3 結 論

SPME技術是一種新型的樣品前處理技術，它利用待測物對活性固體表面的吸附力而達到分離富集的目的，因萃取不破壞樣品本身的性質，而又具有簡單、快速、環(huán)保、靈敏度和精密度高的優(yōu)點，SPME－GC/MS聯用的方法已被廣泛應用于包括體液、組織等多種生物樣品中化學成分的檢測。本研究應用SPME－GC/MS聯用的方法，準確定性、定量檢測大頭金蠅不同時期的幼蟲及蛹樣本的CLP濃度，檢出限為0.1μg/L，在5～5 000μg/L范圍內線性良好，不同濃度的回收率在93%～104%間，日內及日間RSD均小于8%。

該方法結果可靠，簡便快捷，精密度好，可用于此類中毒案件的法醫(yī)學分析測定，昆蟲樣本可作為替代或補充樣本，與腐敗組織及體液相比，昆蟲體內的藥（毒）物保存時間更穩(wěn)定持久[20－21]，在難以獲得合適的組織體液樣本及尸體嚴重腐敗，影響儀器檢測效果的案件中有重要價值。另一方面，對疑為謀殺后偽裝CLP中毒，有蠅蛆孳生的案件，可檢測尸體特殊部位昆蟲樣本獲得間接證據，為案件分析提供參考依據。本研究顯示，大頭金蠅樣本內CLP水平與食物內的含量具有相關性，不同階段大頭金蠅樣本CLP含量隨時間的變化而改變，取食階段的幼蟲體內含量可不斷蓄積到較高水平，到達離食期后由于幼蟲停止取食加上正常的排泄導致體內CLP水平急劇下降。部分研究[4，12，22]也表明，藥（毒）物在昆蟲體內存在明顯的蓄積及分解代謝活動，可引起體內藥物水平及成分的明顯改變，因此今后的研究還要加強代謝物的檢測，以獲得更為精確的結果。

[1]NOLTE K B，PINDER R D，LORD W.Insect larvae used to detect cocaine poisoning in a decomposed body[J].J Forensic Sci，1992，37（4）：1 179－1 185.

[2]KINTZ P，GODELAR B，TRACQUI A，et al.Fly larvae：a new toxicological method of investigation in forensic medicine[J].J Forensic Sci，1990，35（1）：204－207.

[3]BEYER J，ENOS W，STAJIC M.Drug identification through analysis of maggots[J].J Forensic Sci，1980，25（2）：411－412.

[4]KHARBOUCHE H，AUGSBURGER M，CHERIX D，et al.Codeine accumulation and elimination in larvae，pupae，and imago of the blowfly Lucilia sericata and effects on its development[J].Int J Legal Med，2008，122（3）：205－211.

[5]WOOD M，LALOUP M，PIEN K，et al.Development of a rapid and sensitive method for the quantitation of benzodiazepines in Calliphora vicina larvae and puparia by LC－MS/MS[J].J Anal Toxicol，2003，27（7）：505－512.

[6]GOSSELIN M，DI FAZIO V，WILLE S M，et al.Methadone determination in puparia and its effect on the development of Lucilia sericata （Diptera，Calliphoridae）[J].Forensic Sci Int，2011，209（11 213）：154－159.

[7]ROETERDINK E M，DADOUR IR，WATLING R J.Extraction of gunshot residues from the larvae of the forensically important blowfly Calliphora dubia（Macquart）（Diptera：Calliphoridae）[J].Int J Legal Med，2004，118（2）：63－70.

[8]GOSSELIN M，WILLE SMR，FERNANDEZ MMR，et al.Entomotoxicology，experimental set－up and interpretation for forensic toxicologists[J].Forensic Sci Int，2011，208（11 213）：1－9.

[9]GOFF M L，MILLER M L，PAULSON J D，et al.Effects of 3，4－methylenedioxymethamphetamine in decomposing tissues on the development of Parasarcophaga ruficomis（Diptera：Sarcophagidae）and detection of the drug in postmortem blood，liver tissue，larvae，and puparia[J].J Forensic Sci，1997，42（2）：276－280.

[10]LIU X，SHI Y，WANG H，et al.Determination of Malathion levels and its effect on the development of Chrysomya megacephala（Fabricius）in South China[J].Forensic Sci Int，2009，192（1）：14－18.

[11]MILLER M，LORD W，LEE GOFF M，et al.I－solation of amitriptyline and nortriptyline from fly puparia（Phoridae）and beetle exuviae（Dermestidae）associated with mummified human remains[J].J Forensic Sci，1994，39：1 305－1 305.

[12]PIEN K，LALOUP M，PIPELEERS－MARICHAL M，et al.Toxicological data and growth characteristics of single post－feeding larvae and puparia of Calliphora vicina（Diptera：Calliphoridae）obtained from a controlled nordiazepam study[J].Int J Legal Med，2004，118（4）：190－193.

[13]LEVINE B，GOLLE M，SMIALEK J E.An un－usual drug death involving maggots[J].Am J Forensic Med Pathol，2000，21（1）：59－61.

[14]DRUMMER O H，GEROSTAMOULOS J.Postmortem drug analysis：analytical and toxicological aspects[J].Ther Drug Monit，2002，24（2）：199－209.

[15]NOLTE K B，PINDER R D，LORD W D.Insect larvae used to detect cocaine poisoning in a decomposed body[J].J Forensic Sci，1992，37（4）：1 179－1 185.

[16]BOUREL B，TOURNEL G，HEDOUIN V，et al.Morphine extraction in necrophagous insects remains for determining ante－mortem opiate intoxication[J].Forensic Sci Int，2001，120（1－2）：127－131.

[17]SADLER D，FUKE C.Drug accumulation and elimination in Calliphora vicina larvae[J].Forensic Sci Int，1995，71（3）：191－197.

[18]CARVALHO LML，LINHARES A X，TRIGO J R.Determination of drug levels and the effect of diazepam on the growth of necrophagous flies of forensic importance in southeastern Brazil[J].Forensic Sci Int，2001，120（1/2）：140－144.

[19]CAMPOBASSO C P，GHERARDI M，CALIGARA M，et al.Drug analysis in blowfly larvae and in human tissues：a comparative study[J].Int J Legal Med，2004，118（4）：210－214.

[20]SKOPP G，POTSCH L，KLINGMANN A，et al.Stability of morphine， morphine－3－glucuronide，and morphine－6－glucuronide in fresh blood and plasma and postmortem blood samples[J].J Anal Toxicol，2001，25（1）：2－7.

[21]SCHLOEGL H，DRESEN S，SPACZYNSKI K，et al.Stability of ethyl glucuronide in urine，post－mortem tissue and blood samples[J].Int J Legal Med，2006，120（2）：83－88.

[22]PARRY S，LINTON S M，FRANCIS P S，et al.Accumulation and excretion of morphine by Calliphora stygia，an Australian blow fly species of forensic importance[J].J Insect Physiol，2011，57（1）：62－73.