地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉體外誘導(dǎo)1例AM L－M 2復(fù)發(fā)患者原始細(xì)胞凋亡分化的作用研究

陳瓊娜 王曄愷 周吉航 李翊衛(wèi) 曾 芳 劉曉光

地西他濱(decitabine，DCA)主要成分為5－雜氮－2'－脫氧胞苷，為一種去甲基化藥物，目前獲批用于中高危骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)的治療。在先前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)體外AML細(xì)胞株中利用DCA可引起其生長(zhǎng)抑制、促其凋亡和分化［1］。在國(guó)外臨床試驗(yàn)中，DCA聯(lián)合某些組蛋白去乙?；敢种苿┧幬锶绫焖徕c(valproic acid，VPA)對(duì)難治/復(fù)發(fā)性AML患者往往能收到較好的療效［2］。由于國(guó)內(nèi) DCA尚未正式獲批用于AML的治療，因此我們通過(guò)分選一例難治/復(fù)發(fā)性的AML－M2患者的原始細(xì)胞，體外觀(guān)察兩藥物對(duì)其促凋亡和分化的影響，為兩藥聯(lián)合治療AML提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.儀器和試劑:地西他濱(5－氮雜－2'－脫氧胞嘧啶核苷粉劑)購(gòu)自Sigma，丙戊酸鈉粉劑(德巴金針)購(gòu)自賽諾菲－安萬(wàn)特，AnnexinⅤ/PI凋亡試劑盒、CD14－FITC、CD117－PE均購(gòu)自美國(guó)BD公司，流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD FACSCalibur帶分選模塊。

2.病例簡(jiǎn)介:患者，女性，2010年5月初發(fā)AML－M2a，47歲，經(jīng)阿糖胞苷聯(lián)合柔紅霉素聯(lián)合化療后獲得初步緩解，10個(gè)月后復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)時(shí)仍為M2a，外周血WBC 1.7×109/L，RBC 2.74×109/L，Hb 101g/L，PLT 123×109/L。原始細(xì)胞群主要流式髓系免疫表型:CD117:76.33%，CD14:11.13%，CD11b: 18.12%，CD13:37.32%，CD33:3.62%。

3.流式分選:使用患者復(fù)發(fā)時(shí)的骨髓2ml，溶血后以CD45－SSC設(shè)門(mén)(圖1)，選取中等CD45表達(dá)和低SSC的原始細(xì)胞群(圖1)，分選至50ml分選管，分選多管(分選模式為得率優(yōu)先)，高速離心富集。

圖1 AM l－M 2a原始細(xì)胞分選

4.細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理:將富集后的細(xì)胞采用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)加入藥物(藥物設(shè)立分組見(jiàn)表1)，配制濃度為1×105個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，2毫升/孔，置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，，作用48h后各孔吸出培養(yǎng)液，分為3份進(jìn)行以下各步實(shí)驗(yàn)，每份設(shè)置6個(gè)藥物濃度組，每組設(shè)3復(fù)孔。

表1 藥物濃度組設(shè)立(其中藥物濃度均為終濃度)

5.AnnexinⅤ/PI標(biāo)記法觀(guān)察凋亡:取“細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理”步驟中第1份細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌棄上清，殘?jiān)?xì)胞收集至流式管。每管加10μl Annexin V和5μl PI，避光靜置15min，加200μl預(yù)冷的PBS，振蕩混勻，上機(jī)檢測(cè)其早期凋亡率。

6.CD117、CD14檢測(cè):細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理步驟第2、3份細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌棄上清，殘?jiān)?xì)胞收集至流式管。第2份加CD117 10μl，第3份加CD14各10μl，避光靜置15min上機(jī)，計(jì)算CD117和CD14表達(dá)率。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 13.0軟件，對(duì)各組中早期凋亡率、CD117和CD14表達(dá)率做單因素方差分析和LSD兩兩檢驗(yàn)，以P＜0.05為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.AnnexinⅤ/PI標(biāo)記法檢測(cè)凋亡:見(jiàn)圖2，空白對(duì)照組、DCA單藥A組、DCA單藥B組、VPA單藥組、聯(lián)合用藥A組、聯(lián)合用藥B組的早期凋亡率分別為12.12%±0.84%、15.32%±0.75%、24.11%± 2.10%、14.11% ±2.13%、38.14% ±2.10%、44.11%±2.12%，聯(lián)合用藥A組高于DCA單藥A組和VPA單藥組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，聯(lián)合用藥B組高于DCA單藥B組和VPA單藥組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖2 各藥物濃度組早期凋亡率(Annexin V+/PI－)

2.CD117、CD14分化抗原檢測(cè):見(jiàn)圖3、圖4，空白對(duì)照組、DCA單藥A組、DCA單藥B組、VPA單藥組、聯(lián)合用藥A組、聯(lián)合用藥B組的CD117表達(dá)率分別為70.22%±1.92%、66.90%±1.23%、60.32%± 2.10%、65.17% ±1.09%、51.19% ±1.46%、40.30%±2.18%，聯(lián)合用藥A組低于于DCA單藥A組和VPA單藥組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，聯(lián)合用藥B組低于DCA單藥B組和VPA單藥組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。DCA單藥A組、DCA單藥B組、VPA單藥組、聯(lián)合用藥A組、聯(lián)合用藥 B組的 CD14表達(dá)率分別為7.32% ± 0.32%、9.11%±0.47%、13.45%±1.02%、12.22%± 0.91%、17.13%±1.45%、19.11%±1.69%，聯(lián)合用藥A組高于DCA單藥A組和VPA單藥組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，聯(lián)合用藥B組高于DCA單藥B組和VPA單藥組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

討論

DCA作為一種甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，主要通過(guò)抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，逆轉(zhuǎn)DNA的甲基化過(guò)程，激活多種抑癌基因表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或向正常細(xì)胞分化［3］。DCA單用治療骨髓異常增生綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)效果已超越傳統(tǒng)治療手段［4～6］。MDS一般在數(shù)月至數(shù)年內(nèi)轉(zhuǎn)化為AML，且部分類(lèi)別的核型異常的MDS進(jìn)展為AML的可能性更大，DCA在MDS治療中的積極成果給治療AML的探索奠定了基礎(chǔ)［7］。DCA對(duì)于部分不能接受標(biāo)準(zhǔn)化療方案(Ara－C+DNR)的老年AML患者、部分MDS轉(zhuǎn)化而來(lái)的AML以及部分難治/復(fù)發(fā)AML患者效果較好，充分顯示了其治療AML的巨大潛力［8，9］。但從目前國(guó)外總體的臨床情況來(lái)看，DCA對(duì)于AML治療效果不如MDS穩(wěn)定，存在較大的個(gè)體差異。國(guó)外研究表明DCA和VPA聯(lián)用在體外多種腫瘤細(xì)胞中均體現(xiàn)出較佳的抗腫瘤活性和恢復(fù)抑癌基因表達(dá)的效果，如盧等［10］聯(lián)用DCA和VPA對(duì)U266細(xì)胞恢復(fù)抑癌基因RASSF1A基因的表達(dá)，Luszczek等［11］聯(lián)用DCA和VPA作用于小細(xì)胞肺癌引起其DNA損傷。這都說(shuō)明表觀(guān)遺傳學(xué)調(diào)控中，組蛋白去乙?；虳NA甲基化兩種機(jī)制可以相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)控細(xì)胞活性。由于目前國(guó)內(nèi)DCA尚未正式獲批用于AML患者的治療，因此我們通過(guò)流式分選出AML患者的骨髓原始細(xì)胞體外與藥物作用觀(guān)察其對(duì)白血病細(xì)胞的促凋亡分化作用。本研究顯示DCA和VPA體外顯示出協(xié)同促原始細(xì)胞凋亡的能力，其中空白對(duì)照組的早期凋亡率達(dá)到了10%左右，可能和細(xì)胞經(jīng)流式電極分選后的表面輕度損傷有關(guān)。

在臨床治療MDS的應(yīng)用中，DCA主要的不良反應(yīng)為骨髓抑制導(dǎo)致血三系降低，進(jìn)而引起感染風(fēng)險(xiǎn)的增加，一般需要口服抗生素加以預(yù)防。有報(bào)道顯示，DCA能促進(jìn)MDS－RAEB細(xì)胞株SKM－1向成熟髓系細(xì)胞分化，增強(qiáng)CD14和CD11b成熟髓系抗原的表達(dá)，CD14為脂多糖(LPS)受體，存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面的白細(xì)胞分化抗原，識(shí)別、結(jié)合LPS，介導(dǎo)LPS性細(xì)胞反應(yīng)，在LPS性炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素休克等病理反應(yīng)中起重要作用［12，13］。本研究顯示DCA和VPA體外聯(lián)用能促進(jìn)CD14的表達(dá)，提示其增強(qiáng)了體外抗革蘭陰性菌能力。CD117作為c－kit受體膜外區(qū)分子表面抗原標(biāo)志，表達(dá)于造血祖細(xì)胞、不成熟粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，多數(shù)AML的原始細(xì)胞中均有CD117的表達(dá)，并且CD117的高表達(dá)和細(xì)胞的惡性程度相關(guān)，往往預(yù)示著預(yù)后不良。本研究還顯示VPA協(xié)同DCA降低CD117的表達(dá)，從分化抗原角度說(shuō)明它們能共同作用于降低腫瘤細(xì)胞的惡性程度。但是體內(nèi)兩藥聯(lián)用是否也存在類(lèi)似的效應(yīng)，尚需進(jìn)一步研究。

1 王曄愷，周吉航，周世權(quán)，等.急性髓系白血病患者h(yuǎn)Per3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及其去甲基化對(duì)白血病細(xì)胞增殖的影響［J］.中華血液學(xué)雜志，2011，32(5):317－321

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