清熱除濕顆粒提取工藝研究

朱建新，王宏，何薇*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京100010;2.北京市中醫(yī)研究所，北京100010)

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院皮膚科常用協(xié)定處方——清熱除濕湯是由已故著名中醫(yī)皮外科專家趙炳南教授根據(jù)龍膽瀉肝湯化裁而來(lái)，為皮膚科臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗(yàn)方劑，該方對(duì)急性濕疹、接觸性皮炎、帶狀皰疹、藥疹等皮膚病急性濕熱癥有較好的療效，同時(shí)體現(xiàn)了中醫(yī)異病同治治療原則的臨床優(yōu)越性。方中龍膽性寒，味苦，歸肝、膽經(jīng)，具有清熱燥濕，瀉肝膽火的功效，為君藥;黃芩性寒，味苦，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎等作用，為臣藥;車前草性寒，味甘，歸肝、腎、肺、小腸經(jīng)，具有清熱利尿通淋，祛痰，涼血，解毒的作用，為佐藥。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)其提取工藝進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，確定影響提取工藝的顯著性因素。已有的研究表明［1-3］，龍膽、黃芩等有效成分在乙醇中有較高溶解度，故這幾味藥材均采用乙醇提取;白茅根［4-5］等藥材含有豐富的多糖具有水溶性，故采用水提。結(jié)果報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent1100高效液相色譜儀(G1312A型泵，G1365B型檢測(cè)器);SK7210HP超聲波清洗機(jī);DU 800紫外分光光度計(jì);ZK-072型真空干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠);METTLER TOLEDO精密電子天平。

1.2 試藥龍膽苦苷、黃芩苷、無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)分別為:110770-200409;110715-201016;110833-200904);大車前苷對(duì)照品(由上海華壹生物科技有限公司提供，經(jīng)HPLC分析，純度≥98%，CAS:104777-68-6);甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司提供);乙腈(色譜純，CNW公司提供)。其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 醇提工藝考察方法

2.1.1 龍膽苦苷測(cè)定方法

2.1.1.1 色譜條件［6］色譜柱為Kromasil 100-5 C18(150 mm×4.6 mm);流動(dòng)相為水-甲醇(75∶25);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm;柱溫為室溫;理論塔板數(shù)按龍膽苦苷計(jì)算應(yīng)不低于4 000;在此條件下，供試品中龍膽苦苷峰與其他峰能達(dá)到基線分離，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備取龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。精密移取上述龍膽苦苷對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5 mL，置5 mL量瓶中，甲醇定容，進(jìn)樣量為5 μL，依法測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)與峰面積作圖，進(jìn)行回歸處理，得龍膽苦苷回歸方程為:Y=1 035.8X+10.136(r=0.999 8)，表明龍膽苦苷在0.25～2.5 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.2 黃芩苷測(cè)定方法

2.1.2.1 色譜條件［6］色譜柱為Kromasil 100-5PHENYL(250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相為0.2%磷酸溶液-甲醇(53∶47);體積流量為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;柱溫為室溫;理論塔板數(shù)為按黃芩苷計(jì)算應(yīng)不低于2 500;在此條件下，供試品中黃芩苷峰與其他峰能達(dá)到基線分離，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 黃芩苷和樣品HPLC色譜圖

2.1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密稱取已干燥(60℃減壓干燥4 h)的黃芩苷對(duì)照品0.010 2 g，用甲醇定容于25 mL量瓶中，制成0.408 0 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取上述黃芩苷對(duì)照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0 mL，置5 mL量瓶中，甲醇定容，濾過(guò)，分別注入液相色譜儀，進(jìn)樣量為5 μL，按上述條件測(cè)定黃芩苷峰面積，分別以黃芩苷峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行回歸處理，得回歸方程為:Y=3 630.5X－198.27(r=0.999 9)，表明黃芩苷在0.081 6～0.816 0 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 大車前苷測(cè)定方法［7］

2.1.3.1 色譜條件色譜柱為Kromasil 100-5PHENYL(250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液-乙腈(81∶19);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm;柱溫為室溫;理論塔板數(shù)按大車前苷計(jì)算應(yīng)不低于3 000;在此條件下，供試品中大車前苷峰與其他峰能達(dá)到基線分離，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 大車前苷和樣品HPLC色譜圖

2.1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密稱取大車前苷對(duì)照品0.002 53 g，用60%甲醇定容于25 mL量瓶中，制成0.101 2 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取上述大車前苷對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置10 mL量瓶中，60%甲醇定容，濾過(guò)，進(jìn)樣量為30 μL，依法測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)與峰面積作圖，進(jìn)行回歸處理，得大車前苷回歸方程為:Y=1 129.7X+8.376 4(r=0.999 6)，表明大車前苷在0.151 8～1.821 6 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.4 正交設(shè)計(jì)篩選最佳提取工藝

2.1.4.1 提取因素及水平的確定擬以A含乙醇量(%)、B乙醇用量(倍)、C提取時(shí)間(h)、D提取次數(shù)(次)為主要考察因素，選用L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，各因素的相關(guān)水平見(jiàn)表1。

表1 醇提工藝因素水平

2.1.4.2 提取方法及結(jié)果分析按處方稱取龍膽、黃芩、車前草等藥材，按照正交設(shè)計(jì)條件提取，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 醇提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)直觀分析和方差分析可知，影響該工藝的因素依次為D＞C＞B＞A，A、B、C、D四個(gè)因素的差異均具有顯著性(P＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表3。最佳提取工藝為A2B3C3D3，即70%乙醇，12倍量，提取3次，每次1.5 h。

表3 綜合評(píng)分方差分析

2.1.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)稱取處方量的龍膽等藥材5份，按最佳工藝進(jìn)行提取，龍膽苦苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.70%，RSD為0.95%(n=5);黃芩苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.15%，RSD為1.03%(n=5);大車前苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.51%，RSD為1.07%(n=5)，浸膏平均得率為35.28%。該條件下指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)較穩(wěn)定，因此該工藝是合理可行的。

2.2 水提取工藝的考察

2.2.1 多糖含有量測(cè)定方法

2.2.1.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定［8］取適量顯色后的對(duì)照品溶液，于300～600 nm范圍內(nèi)掃描，在485 nm處有最大吸收，故選定最大吸收波長(zhǎng)為485 nm。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備［9］精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品50 mg，置于50 mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，配制成1 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。精密量取上述對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別置于50 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液2 mL置具塞試管中，分別加入1.0 mL 5%苯酚溶液，再垂直快速加入濃硫酸5 mL，充分振搖，置沸水浴上加熱15 min，取出，置冷水浴中冷卻30 min，于485 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為:Y=0.055 6X－0.098 9，r=0.999 3，葡萄糖在5～30 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 浸膏得率測(cè)定稱取干燥至恒質(zhì)量的各樣品，按下式計(jì)算浸膏得率:浸膏得率(%)=浸膏質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100%。

2.2.3 試驗(yàn)方法及結(jié)果分析

2.2.3.1 正交設(shè)計(jì)篩選提取工藝［10］擬以A提取次數(shù)(次)、B提取時(shí)間(h)、C加水量(倍)為主要考察因素，選用L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，各因素的相關(guān)水平見(jiàn)表4。

表4 水提工藝因素水平

2.2.3.2 樣品制備及測(cè)定取處方量的白茅根、茯苓、生地黃等藥材，按照L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，回流提取，濾過(guò)，合并濾液，濃縮，移至200 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。精密吸取50 mL，在攪拌狀態(tài)下，加入4倍量無(wú)水乙醇沉淀多糖，4℃冰箱靜置24 h，過(guò)濾，取沉淀，60℃減壓干燥至恒質(zhì)量，精密稱量，即得。精密稱取樣品5 mg，置于50 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度。精密量取1 mL置于具塞試管中，按2.2.1.2項(xiàng)下方法測(cè)定樣品的吸光度，代入回歸方程，計(jì)算多糖的含有量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3.3 結(jié)果分析由表5的直觀分析可以看出，3因素中A即提取次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大，為多糖提取工藝的主要影響因素，影響次序依次為A＞B＞C。進(jìn)一步的方差分析表明，A因素對(duì)浸膏得率的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，對(duì)多糖含有量的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，B、C因素對(duì)浸膏得率和多糖含有量的影響都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合考慮工藝成本，在多糖的提取工藝中，最佳提取工藝為A3B2C1，即加8倍量的水提取3次，每次2 h。結(jié)果見(jiàn)表6、表7。

表6 浸膏得率方差分析

表7 多糖含有量方差分析

2.2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)按處方稱取白茅根、茯苓等六味藥，按照最佳提取條件A3B2C1提取多糖，計(jì)算多糖平均含有量為6.02%，RSD為0.69%(n=5)，浸膏得率平均為11.59%，RSD為1.37%(n=5)，說(shuō)明優(yōu)化后的工藝條件，多糖產(chǎn)率高，重復(fù)性好。

3 討論

3.1 前期通過(guò)抗炎藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)［11］確定清熱除濕顆粒的提取方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方法(傳統(tǒng)水煎法、分類提取法)提取的清熱除濕湯均可顯著抑制小鼠耳腫脹，與模型對(duì)照組比較，存在顯著性差異(P＜0.01);分類提取法提取的清熱除濕顆粒的抗炎效果優(yōu)于傳統(tǒng)水煎法。因此，確定了清熱除濕湯的提取方法為分類提取法。

3.2 由于本方為治療急性濕疹、皮炎，故該類制劑產(chǎn)品應(yīng)便于患者攜帶和貯存;另外，整個(gè)處方的出膏率為17.4%，出膏量為22 g，即使在不加輔料的情況下，也很難制備成片劑或膠囊劑，故選擇為顆粒劑。

3.3 清熱除濕顆粒為中藥復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，龍膽苦苷為本方中君藥龍膽的主要有效成分，黃芩苷為臣藥黃芩的主要有效成分。用單一考察指標(biāo)篩選中藥提取工藝條件并不全面，單一指標(biāo)的優(yōu)劣并不能完全代表中藥制劑整體質(zhì)量的優(yōu)劣［12］。因此，本實(shí)驗(yàn)在清熱除濕顆粒醇提取工藝的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)中，采用了3指標(biāo)評(píng)價(jià)法，以綜合考察提取工藝的優(yōu)劣。

3.4 水提取工藝中多糖的含有量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)原理［13］為多糖在濃硫酸作用下水解成單糖并迅速脫水生成糖醛，然后與苯酚縮合成有色化合物，用分光光度法測(cè)定其含有量。本法顯色穩(wěn)定，靈敏度高。苯酚試劑應(yīng)為新鮮配置，且冷藏避光保存，否則以蒸餾水作空白對(duì)照時(shí)顏色加深，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有干擾。

［1］楊維霞，周樂(lè)，耿會(huì)玲，等.龍膽科藥用植物化學(xué)成分的研究現(xiàn)狀［J］.西北植物藥學(xué)，2008，23(12):2235-2240.

［2］孫鳳嬌，廖克儉，叢玉風(fēng).黃芩提取工藝的優(yōu)化研究［J］.精細(xì)石油化工進(jìn)展，2008，9(11):51-52.

［3］熊淑華，熊愛(ài)珍，方曉，等.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選黃芩的提取工藝［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，5(2):46-47.

［4］劉榮華，付麗娜，陳蘭英，等.白茅根化學(xué)成分與藥理研究進(jìn)展［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，22(4):80-83.

［5］王瑩，孟憲生，包永睿，等.白茅根多糖提取工藝優(yōu)化及含量測(cè)定［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5(11):24-26.

［6］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［7］孫虔，耿放，程雪梅，等.車前草中大車前苷的定性和定量分析［J］.中國(guó)中藥雜志，2010，35(16):2095-2098.

［8］張亞環(huán)，陳萍，王小芳，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選黃芪多糖的水提工藝研究［J］.化學(xué)世界，2007(6):345-347.

［9］劉依.板藍(lán)根有效成分的提取分離及含量測(cè)定［D］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002:21-22.

［10］張國(guó)華，李邵平，季暉，等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化冬蟲(chóng)夏草多糖的提取工藝［J］.安徽醫(yī)藥，2004，8(6):404-405.

［11］朱建新，何薇.清熱除濕湯提取方法的實(shí)驗(yàn)研究［C］//中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)制劑分會(huì)世界中聯(lián)中藥藥劑專業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集.昆明:中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)制劑分會(huì)世界中聯(lián)中藥藥劑專業(yè)委員會(huì)，2011:131-133.

［12］羅友華，程剛，李成付，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選咽舒寧顆粒劑的提取工藝［J］.中國(guó)藥劑學(xué)雜志，2009，7(4):299-304.

［13］陳惠紅，馮艷玲，蘇艷妮.正交試驗(yàn)優(yōu)選神光源顆粒劑的提取工藝［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2007，21(5):46-48.