HPLC法測定復方苦參洗劑中鹽酸小檗堿和黃芩苷

吳雪丹， 丁寶月， 傅應華*

(1.浙江省象山縣第一人民醫(yī)院，浙江象山 315700;2.嘉興學院醫(yī)學院，浙江嘉興 314001)

復方苦參洗劑處方由苦參、黃柏、蛇床子、百部、黃芩等十五味中藥組成，具有清熱解毒、燥濕止瘙功效，用于改善婦女帶下過多，外陰瘙癢等癥狀。原藥品質量標準(試行)［1］鑒別項下規(guī)定了黃柏、黃芩的薄層色譜鑒別，定量測定項下規(guī)定了蛇床子素含有量測定，規(guī)定每1 mL含蛇床子素不得少于8 μg。黃柏有效成分之一為鹽酸小檗堿［2］，黃芩有效成分之一為黃芩苷［2］，兩者均具有抗菌消炎作用，需要定量控制。有關鹽酸小檗堿和黃芩苷的定量測定方法主要有高效液相色譜法等［3-14］。為提高中藥復方制劑質量標準，本實驗對色譜條件進行了摸索，建立了HPLC法梯度洗脫同時測定復方苦參洗劑中鹽酸小檗堿和黃芩苷。

1 儀器與材料

美國Dionex高效液相色譜儀由P680四元低壓梯度泵，UVD170U紫外-可見檢測器，ASI-100自動進樣器，Chromeleon色譜數據工作站組成;BP211D電子天平(精度±0.01 mg，賽多利斯科學儀器有限公司);USC502型超聲波清洗器(上海波龍電子設備有限公司)。

鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110713-200609，純度98.1%)，黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110715-200815，純度95.2%)，復方苦參洗劑樣品9批(規(guī)格:100 mL相當于含生藥黃柏、黃芩各1 g)，批號分別為 20110302，20110303，20110315，20110413，20110411，20110419，20110422，20110425，20110501(浙江中法制藥有限公司提供 )。乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent XDB-C18柱(4.6 mm×25 cm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL中含辛烷磺酸鈉0.1g)(20∶80)，維持0～3 min;在 3～17 min流動相比例線性改變至(40∶60)， 17～25 min; 1.0 mL/min;檢測波長280 nm;進樣量20 μL;柱溫30℃。在此色譜條件下，鹽酸小檗堿和黃芩苷之間以及與其它相鄰雜質峰的分離度均符合要求(R＞1.5)，理論板數以黃芩苷峰計算應不低于5 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取對照品黃芩苷9.46 mg、鹽酸小檗堿1.66 mg，用甲醇定容10 mL量瓶，分別制成0.946 mg/mL和0.166 mg/mL的貯備液。再精密量取適量，用甲醇稀釋至黃芩苷36.02 mg/mL，鹽酸小檗堿6.51 mg/mL，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取復方苦參洗劑5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇 15 mL，超聲(功率160 W，工作頻率56 kHz)處理10 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經0.45μm濾膜過濾，濾液即為供試品溶液。

2.3 陰性對照液的制備 按處方比例稱取除黃柏、黃芩以外的其余藥材，按照復方苦參洗劑制備工藝制備缺黃芩、黃柏的雙空陰性樣品。按照2.2.2項下方法操作，制成缺黃芩、黃柏的陰性對照液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗 分別吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照液，進樣分析。結果陰性對照液在鹽酸小檗堿峰和黃芩苷峰位置上沒有峰出現，對供試品測定無干擾。結果見圖1。

2.5 線性關系考察 取0.166 mg/mL、0.946 mg/mL的混合對照品貯備液用甲醇稀釋至鹽酸小檗堿3.3、6.5、9.8、13.0、16.3、24.4 μg/mL，黃 芩 苷18.0、36.0、54.0、72.0、90.1、135.1 μg/mL，注入高效液相色譜儀進行測定，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標，對照品質量濃度X(μg/mL)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程:鹽酸小檗堿Y=0.876 5X+0.089 6，r=0.999 8;黃芩苷Y=0.998 3X+0.490 2，r=0.999 8。表明鹽酸小檗堿在 3.3 ～24.4 μg/mL，黃芩苷在 18.0 ～135.1 μg/mL 。

圖1 對照品(A)、復方苦參洗劑(B)和缺黃柏、黃芩陰性對照(C)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A)，sample(B)and negative sample without Phellodendri chinensis Cortex and Scutellariae Radix(C)

2.6 精密度試驗 取混合對照品溶液(鹽酸小檗堿 6.51 μg/mL，黃芩苷 36.02 μg/mL)，重復進樣 6次，結果鹽酸小檗堿和黃芩苷峰面積的RSD分別為1.09%、0.93%。

2.7 重復性試驗 取同一批樣品(批號20110413)，平行制備6份供試品溶液，進樣分析，計算鹽酸小檗堿和黃芩苷質量分數的RSD分別為2.50%、1.81%。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批樣品(批號20110413)的供試品溶液，室溫放置，分別于 0、2、4、6、8，16 h 進樣分析，計算鹽酸小檗堿和黃芩苷峰面積的RSD分別為1.37%、1.28%。表明供試品溶液在16 h內穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗 精密量取復方苦參洗劑陰性對照樣品5 mL，共6份，各精密加入鹽酸小檗堿0.116 mg/mL及黃芩苷1.106 mg/mL的混合對照品貯備液1 mL，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，進樣分析，計算鹽酸小檗堿及黃芩苷的回收率，結果見表1、表2。

表1 鹽酸小檗堿回收率試驗結果(n=6)Tab.1 Recovery results of berberine hydrochloride in sample(n=6)

表2 黃芩苷回收率試驗結果(n=6)Tab.2 Recovery results of baicalin in sample(n=6)

2.10 樣品測定 取9批樣品，制備供試液，進樣分析，記錄色譜圖，按外標法峰面積計算鹽酸小檗堿及黃芩苷的質量濃度，結果見表3。

表3 樣品中鹽酸小檗堿和黃芩苷測定結果(n=3)Tab.3 Determination of baicalin and berberine hydrochloride in lotions samples(n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 以甲醇為溶劑，分別測定了鹽酸小檗堿和黃芩苷的紫外光譜圖，鹽酸小檗堿最大吸收波長為266 nm，黃芩苷最大吸收波長為275 nm。兩者在波長280 nm處有等吸收點，實驗選擇280 nm作為檢測波長，鹽酸小檗堿和黃芩苷均有較，， 。

3.2 溶劑的選擇 復方苦參洗劑為經水煎煮制成的中藥制劑，水溶性雜質較多，在進樣前需經純化處理。采用甲醇作溶劑，沉淀物較松，易于過濾;而采用乙醇作溶劑，沉淀物呈黏稠狀，不易過濾，故選擇甲醇作溶劑。

3.3 提取時間的選擇 取樣品分別超聲處理5、10、15、20 min，制備供試液，測定鹽酸小檗堿和黃芩苷，結果超聲處理10、15、20 min含有量無差異，故確定超聲處理為10 min。

3.4 溶劑用量的選擇 取樣品5 mL，分別加入甲醇10、15、20 mL，制備供試品液，測定鹽酸小檗堿和黃芩苷，結果溶劑用量10、15、20 mL含有量無差異，確定甲醇用量為15 mL。

3.5 流動相系統(tǒng)的優(yōu)化 試驗發(fā)現，當采用乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)作流動相，乙腈比例為50%時，黃芩苷保留時間為2.7 min，鹽酸小檗堿23 min未出峰;在0.1%磷酸中加入0.1%辛烷磺酸鈉，保持乙腈比例不變，黃芩苷保留時間不變，鹽酸小檗堿保留時間為4.4 min，而降低乙腈比例，黃芩苷、鹽酸小檗堿保留時間均延長。考慮到復方制劑成分復雜，采用梯度洗脫更能調整好黃芩苷、鹽酸小檗堿兩組分出峰時間，經反復修改有機相比例，優(yōu)化各組分的分離度，達到黃芩苷、鹽酸小檗堿與相鄰組分峰分離度均符合規(guī)定，確定的梯度洗脫程序具有重復性好、柱效高、出峰速度快等優(yōu)點。另對磷酸與辛烷磺酸鈉的濃度進行考察，結果表明，在分離度滿足要求的前提下，盡量減少磷酸和辛烷磺酸鈉的質量濃度，以0.1%磷酸和0.1%辛烷磺酸鈉為宜。同時，試驗也表明，色譜柱選用25 cm長柱較好，可增加各組分的保留值，有利于各組分的分離。

3.6 含量限度的擬定 從表3中9批樣品的測定結果看，黃芩苷、鹽酸小檗堿質量濃度差異較大，黃芩苷質量濃度范圍在0.016 1～0.039 1 mg/mL之間;鹽酸小檗堿質量濃度范圍在0.158 9～0.256 6 mg/mL之間。為了使產品質量可控，提高療效，質控標準中應增加黃芩苷、鹽酸小檗堿定量測定項目，考慮到不同產地黃芩、黃柏中黃芩苷、鹽酸小檗堿質量濃度的差異，擬定樣品中黃芩苷、鹽酸小檗堿質量濃度應不低于0.20 mg/mL和0.020 mg/mL。

［1］WS-5412(B-0412)-2002.國家藥品監(jiān)督管理局標準(試行)［S］.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:286，282.

［3］傅應華，徐宏祥.消瘰合劑的質量控制項目研究［J］.藥物分析雜志，2010，30(3):526-529.

［4］曾祖平，劉 釗，張 虎，等.芙蓉凝膠質量標準研究［J］.中成藥，2010，32(12):2091-2096.

［5］曾祥林.HPLC法測定泌淋清膠囊中鹽酸小檗堿的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29(8):1361-1363.

［6］李 奕，許 旭.HPLC同時測定一清膠囊中黃芩苷、大黃酸和小檗堿的含量［J］.中成藥，2005，27(2):1555-1577.

［7］金 良，李亞男，張秋燕，等.連梅飲中黃芩苷和小檗堿的含量測定［J］.中國現代醫(yī)藥雜志，2009，11(12):32-35.

［8］馮 波，施春玲，郝乘儀.RP-HPLC法測定芎菊上清丸中黃芩苷［J］.中草藥，2009，40(5):743-745.

［9］褚文靜，張 雪，黃喜茹.RP-HPLC法測定濕毒清片中7種活性成分［J］.中草藥，2010，41(11):1809-1811.

［10］劉存軍.RP-HPLC測定連蒲雙清片中鹽酸小檗堿的含量［J］.中成藥，2007，29(12):1864-1865.

［11］廖偉明，劉桂珍，周國波.HPLC法測定小兒止咳顆粒中黃芩苷的含量［J］.中國藥房，2010，21(31):2946-2947.

［12］劉 芳，張 浩，方清茂，等.黃連上清丸(片)中小檗型生物堿的含量測定［J］.中成藥，2005，27(12):1393-1396.

［13］張國慶，楊更亮，李志偉，等.安宮牛黃膠囊中的黃芩苷和鹽酸小檗堿的HPLC測定［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36(3):176-179.

［14］劉 剛，王海濤，趙 淼，等.HPLC法測定雙黃連口服液中綠原酸和黃芩苷的含量［J］.解放軍藥學學報，2007，23(4):299-302.