五波長高效液相色譜指紋譜定量鑒定速效救心丸

孫國祥， 趙梓余

(沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽110016)

速效救心丸是由川芎、冰片等制成的滴丸劑，用量小、起效快、服用方便，是治療冠心病和心絞痛常用藥物［1-2］。川芎辛、溫，具有止痛、活血、行氣作用。冰片辛、苦，微寒，具有開竅醒神、清熱、止痛作用。兩者合用，可充分發(fā)揮兩藥辛香走竄之力，以達活血化瘀、開竅醒神之功［2］。中藥部頒標準中用TLC鑒定川芎成分并用GC法測定冰片中成分含有量［1］。文獻中測定其中金屬元素［3］和氟［4］，利用紅外光譜進行聚類分析研究［5］。曾用單波長HPLC數(shù)字化指紋譜評價其質量，本實驗建立五波長HPLC指紋圖譜對其質量進行控制。中藥色譜指紋圖譜必然走向對中藥進行整體定量控制，系統(tǒng)指紋定量法是鑒定中藥整體化學物質的簡便可靠方法［6］。通過建立五波長HPLC指紋圖譜對速效救心丸進行全面質量評價，充分挖掘全指紋在最佳波長下信息，以增強方法靈敏度和準確度。

1 儀器、試劑與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，ChemStation工作站(Agilent科技有限公司)，Sarturius-BS110S分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，甲醇(色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠)，乙腈(色譜純，天津市康科德科技有限公司)，磷酸(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)，水為去離子水。

阿魏酸對照品(Ferulic acid，F(xiàn)A，批號 0773-9910)，購自中國藥品生物制品檢定所。藁本內酯對照品(Ligustulide，LGS，純度不低于 99.2%，自制)。12批速效救心丸(天津中新藥業(yè)集團股份有限公司第六制藥廠)，批號:S1(616062)、S2(619256)、S3(610064)、S4(619166)、S5(619187)、S6(619254)、S7(610020)、S8(610097)、S9(619240)、S10(610013)、S11(610098)和 S12(610031)。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件 大連江申CenturySIL C18BDS柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相 A 為水 -0.1%磷酸，B為乙腈-0.1%磷酸;梯度洗脫(0～15 min，5% ～15%B;15～30 min，15% ～30%B;30～50 min，30% ～50%B;50～60 min，50% ～65%B;60～70 min，65% ～85%B;70 ～90 min，85%B);體積流量1.0 mL/min;檢測波長 265 nm，276 nm，290 nm，300 nm和310 nm;柱溫(30±0.15)℃;進樣量20 μL;洗脫時間90 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 用甲醇配制40 μg/mL阿魏酸對照品溶液，同法配制50 μg/mL藁本內酯對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取速效救心丸10粒，精密稱定，加體積分數(shù)75%乙醇溶液定容至10 mL，超聲5 min，搖勻，作供試液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 將S1樣品溶液，阿魏酸和藁本內酯對照品溶液分別進樣20 μL，記錄譜圖，見圖1。確定6號峰為阿魏酸，21號峰為藁本內酯，選藁本內酯峰作參照物峰，其理論板數(shù)應不低于38萬。2 h空針圖證明無干擾峰，依據(jù)2 h供試液圖確定洗脫90 min。

圖1 速效救心丸HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Suxiao Jiuxin Pill

2.4 精密度、重復性及穩(wěn)定性試驗 按上述色譜條件，取S1供試液連續(xù)進樣6次測定精密度;配制S1供試液6份進樣測定重復性;分別在S1樣品供試液制備后0、5、10、15、20、24 h 進樣測定穩(wěn)定性。以藁本內酯峰的保留時間和峰面積為參照，計算五波長下各指紋峰的相對保留時間RSD＜2.0%和相對峰面積的RSD＜5.0%。結果表明精密度和重復性良好，樣品在24 h內穩(wěn)定。

2.5 系統(tǒng)指紋定量法和鑒定標準［7-8］系統(tǒng)指紋定量法是用宏定性相似度Sm整體監(jiān)測化學指紋數(shù)量和分布比例，用宏定量相似度Pm整體監(jiān)測化學指紋整體出峰數(shù)和峰高，用指紋均化性變異系數(shù)α絕對值限定指紋變異性。用三者大小可定量鑒定中藥質量，見表1。

表1 中藥質量級別鑒定標準Tab.1 The criteria of TCM quality grades

2.6 速效救心丸五波長HPLC指紋圖譜建立 將12批供試液進樣分析并記錄色譜圖，見圖2。以藁本內酯為參照物，按峰出現(xiàn)率70%(S/N≥5)計，確定指紋峰為 29(265 nm)、31(276 nm)、29(290 nm)、27(300 nm)和24(310 nm)。將290 nm 圖譜積分AIA文件導入軟件按均值法生成準對照指紋譜(PRFP)并評價12批樣品，以Sm和Pm為指標進行聚類分析得 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S9、S10和S12為第Ⅰ類，S8和S11為第Ⅱ類。依據(jù)Sm和Pm接近，故選第I類10批樣品按均值法生成五波長下對照指紋譜 (RFPs)，再次評價各波長下速效救心丸質量見表2。

圖2 在5個波長下12批速效救心丸HPLC指紋譜和其對照指紋譜Fig.2 HPLC fingerprints of 12 batches of Suxiao Jiuxin Pilland theRFPsunder five wavelength

2.7 用FW-HPLC-FP評價速效救心丸［9］在265、276、290、300、310 nm 波長檢測 12 批樣品Sm，Pm和α見表2，分別以五個波長的對照指紋圖譜作參照。橫向比較12批樣品在任一波長檢測到的化學成分數(shù)量、分布比例和指紋比例變異情況都較相似，但各成分含有量有顯著差異導致質量級變化?？v向比較同一樣品在不同波長質量有顯著差異，說明任何單波長指紋譜鑒定質量結果具有片面性，必須對不同波長結果進行合理整合。

2.8 均值法(AM)和主成分整合法(PCI)評價速效救心丸 將五波長下的Sm，Pm和α取均值重新評價12批速效救心丸見表2。主成分分析是應用廣泛的多元統(tǒng)計方法，用于簡化數(shù)據(jù)，快速實現(xiàn)模式或關系的可視化識別［10］。利用SPSS 16.0分別以Sm、Pm和α值與不同的波長組成矩陣進行主成分分析，以特征值大于1為提取標準，分別得到1、1、3個主成分，主成分的累計貢獻率大于90%。計算時將原始數(shù)據(jù)利用因子系數(shù)得分矩陣重新整合［11］得到新的Sm、Pm和α，再次評價速效救心丸質量級，其結果與均值法鑒定結果完全一致，相互驗證。AM和PCI鑒定出S12(2級)質量很好;S3、S4、S6和S7(3級)質量好;S10(5級)質量中等;S1和S9(7級)質量次;S2、S5、S8 和 S11(8級)質量劣。

3 討論

速效救心丸中主要化學成分有生物堿類川芎嗪、有機酸類阿魏酸和內酯類藁本內酯等，在260～320 nm附近有較強紫外吸收，任何單波長指紋譜無法對速效救心丸進行準確表征。多波長指紋譜能實現(xiàn)指紋譜信息最大化，從DAD所記錄190～400 nm色譜圖中選取重點波長 265、276、290、300、310 nm建立速效救心丸五波長譜可最大限度獲取該制劑中復雜化學指紋定性定量全信息。12批藥物中一批整體指紋含有量過低，三批含有量過高。本實驗結果表明中國藥典僅規(guī)定幾個指標成分含有量下限做法顯然不科學，其嚴重忽視因化學指紋含有量過高而導致的用藥不安全問題。

表2 基于FW-HPLC-FPs定量指紋譜評價12批速效救心丸質量Tab.2 The 12 batches of Suxiao Jiuxin Pill quality evaluated based on FW-HPLC-FPs

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準:制劑第18冊［S］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1998:295.

［2］李 鏷.速效救心丸及其新對藥——川芎、冰片［J］.北京中醫(yī)，2006，25(9):575-576.

［3］董順福，朱志國.速效救心丸中 Ca，Mg，F(xiàn)e，Cu，Zn的測定及Ca/Mg，Cu/Zn比值分析［J］.光譜學與光譜分析，2002，22(3):478-479.

［4］奚克生，董順福，朱志國.氟離子選擇性電極法測定速效救心丸中氟含量［J］.廣東微量元素科學，1998，5(10):54-56.

［5］楊莉麗，王 暢，張德強，等.中成藥速效救心丸的紅外光譜聚類分析研究［J］.光譜實驗室，2010，27(5):2064-2068.

［6］孫國祥，張靜嫻.基于三波長融合譜的系統(tǒng)指紋定量法鑒定龍膽瀉肝丸真實質量［J］.色譜，2009，27(3):318-322.

［7］孫國祥，胡玥珊，畢開順.系統(tǒng)指紋定量法評價牛黃解毒片質量［J］.藥學學報，2009，44(4):401-405.

［8］孫國祥，張靜嫻.系統(tǒng)指紋定量法鑒別龍膽瀉肝丸質量［J］.分析化學研究簡報，2009，37(8):1183-1187.

［9］孫國祥，吳 波，畢開順.平行五波長高效液相色譜指紋圖譜全息整合法定量鑒定杞菊地黃丸的整體質量［J］.色譜，2010，28(9):877-884.

［10］李效賢，熊耀康，余陳欣，等.高效液相色譜指紋圖譜法分析南方紅豆杉藥材的氯仿提取物［J］.色譜，2010，28(11):1067-1070.

［11］陳隨清，魏雅磊，王 靜，等.多指標成分分析確定山茱萸最佳采收期［J］.中國現(xiàn)代中藥，2011，13(1):29-33.