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    蛋白質(zhì)剪接在蛋白質(zhì)研究和蛋白質(zhì)工程中的應(yīng)用

    2012-01-24 08:04:16戴旭東劉相欽
    自然雜志 2012年1期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)含子基因治療外顯子

    戴旭東 孟 清 劉相欽

    ①博士研究生,②教授,東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所,上海 201620;③教授,Department of Biochemistry &Molecular Biology,F(xiàn)aculty of Medicine,Dalhousie University,Halifax,Nova Scotia,Canada B3H1X5

    蛋白質(zhì)剪接(protein splicing)是由蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的在蛋白質(zhì)水平上翻譯后的加工過程。蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是指前體蛋白中的一段插入序列,它在蛋白質(zhì)翻譯后的成熟過程中能自我催化,使自身從前體蛋白中切除,并將其兩側(cè)的多肽片段以肽鍵連接,形成成熟的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)豐富了基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯成熟過程的理論,而且在蛋白質(zhì)研究和蛋白質(zhì)工程中有廣泛的應(yīng)用。本文試圖綜述蛋白質(zhì)剪接在蛋白質(zhì)特異位點標(biāo)記、蛋白質(zhì)片段化標(biāo)記同位素、蛋白質(zhì)環(huán)化、蛋白質(zhì)芯片、基因治療等研究中的應(yīng)用。

    蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是指前體蛋白中的一段插入序列,它在蛋白質(zhì)翻譯后的成熟過程中能自我催化,使自身從前體蛋白中切除,并將其兩側(cè)稱為蛋白質(zhì)外顯子(extein)的多肽片段以正常的肽鍵連接形成有功能的成熟蛋白質(zhì)[1-2]。截至到2011年8月,已經(jīng)有500多種蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)被發(fā)現(xiàn)(inbase,http://www.neb.com/neb/inteins.html)[3]。它們分布在單細(xì)胞真核生物、細(xì)菌、古細(xì)菌、噬菌體和病毒的基因組中,但是在多細(xì)胞生物中尚未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子,而且它們主要分布在與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯有關(guān)的蛋白酶或轉(zhuǎn)移因子上,這可能有利于蛋白質(zhì)內(nèi)含子的歸巢(homing)和生存[4]。由于蛋白質(zhì)剪接能把兩個多肽以一個天然肽鍵相連(splicing),形成成熟的有活性的蛋白質(zhì),為蛋白質(zhì)合成和翻譯后修飾提供了新的途徑,因而蛋白質(zhì)剪接已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到蛋白質(zhì)研究和蛋白質(zhì)工程中。例如,這項技術(shù)可以應(yīng)用到蛋白質(zhì)特異位點標(biāo)記、蛋白質(zhì)片段化標(biāo)記同位素、蛋白質(zhì)環(huán)化、基因治療、蛋白質(zhì)芯片等研究中[5-7]。

    1 蛋白質(zhì)內(nèi)含子的生物學(xué)特性

    1.1 蛋白質(zhì)內(nèi)含子

    1990年,分別由Kane和Hirata領(lǐng)導(dǎo)的研究小組同時在酵母中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)剪接(protein splicing)[8-9]。1994年,Perler將“插入片段”正式命名為“intein”,即蛋白質(zhì)內(nèi)含子。并將其定義為:在蛋白質(zhì)成熟過程中被剪接掉的一段框內(nèi)融合于前體蛋白的氨基酸序列,蛋白質(zhì)內(nèi)含子兩端的序列稱為“extein”,即外顯子[10](圖1)。

    蛋白質(zhì)內(nèi)含子不同于RNA內(nèi)含子,前者存在于蛋白質(zhì),后者則存在于mRNA前體。然而,蛋白質(zhì)內(nèi)含子與RNA內(nèi)含子(intron)也有相似之處。首先,它們都插入到基因中,通過自身剪接從前體中剪接下來,將兩邊的前體連接。另外,二者都包含核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域,可以通過類似的歸巢機(jī)制在基因中轉(zhuǎn)移。

    圖1 蛋白質(zhì)剪接示意圖[1]

    1.2 蛋白質(zhì)內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)

    每一個蛋白質(zhì)內(nèi)含子都包含N端剪接結(jié)構(gòu)域和C端剪接結(jié)構(gòu)域。N端剪接結(jié)構(gòu)包含兩個序列模塊即A和B,C端剪接結(jié)構(gòu)包含兩個序列模塊即F和G。除此之外,標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子在N端剪接結(jié)構(gòu)域和C端剪接結(jié)構(gòu)域之間還存在歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域,由模塊C,D和E組成(圖2)。模塊A位于蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N端,其N端的第一個氨基酸殘基非常保守,一般是Cys或Ser;模塊G位于蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C端,其C端的第一個氨基酸殘基非常保守,一般是Asn,第二個氨基酸殘基也非常保守,一般是His;模塊B中Thr-X-X-His序列的Thr和His非常保守,X是任何氨基酸殘基;另外,C端蛋白質(zhì)外顯子的第一個氨基酸殘基非常保守,一般是Cys,Ser或Thr。越來越多的證據(jù),特別是突變分析和一些蛋白質(zhì)內(nèi)含子晶體結(jié)構(gòu)的解析表明這些保守的氨基酸殘基參與了蛋白質(zhì)的剪接,如果它們發(fā)生突變,將會影響蛋白質(zhì)剪接活性[11]。

    圖2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)示意圖[1]。兩端分別是蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接結(jié)構(gòu)域,中間部分是歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。A,B,C,D,E,F(xiàn),G是蛋白質(zhì)內(nèi)含子的保守模塊。

    1.3 蛋白質(zhì)的順式剪接(cis-splicing)與反式剪接(trans-splicing)

    蛋白質(zhì)內(nèi)含子根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征可分為三類:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子(canonical intein),微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子(miniintein)和斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子(split intein)(圖3)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白內(nèi)含子含有大約400個氨基酸并包括一個歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域,而微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子只有大約140個氨基酸不包含歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域,只有蛋白剪切的功能。雖然很多蛋白內(nèi)含子在序列上沒有同源性,但是它們的晶體結(jié)構(gòu)非常接近。微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子的晶體結(jié)構(gòu)包括12個β折疊,它們形成一個圓盤狀的蛋白質(zhì),其剪切活性中心位于圓盤的中央[11-12]。對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子和微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子來說,蛋白質(zhì)內(nèi)含子和蛋白質(zhì)外顯子位于同一多肽鏈上,這時發(fā)生的蛋白剪接稱為順式剪接(cis-splicing)。斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子是蛋白質(zhì)內(nèi)含子中部區(qū)域特定位點發(fā)生斷裂,被分裂成兩部分即N端區(qū)域(IN)和C端區(qū)域(IC),分別由不同的開放閱讀框(ORF)編碼。斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的IN和IC在剪接時相互識別,然后重建催化活性中心,進(jìn)而發(fā)生蛋白質(zhì)反式剪接(protein trans-splicing)。

    圖3 蛋白質(zhì)的順式剪接(cis-splicing)與反式剪接(trans-splicing)。IN:蛋白質(zhì)內(nèi)含子N端剪接結(jié)構(gòu)域,IC:蛋白質(zhì)內(nèi)含子C端剪接結(jié)構(gòu)域,EN:歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。

    1.4 蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接機(jī)制

    蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接是一個自我催化過程,只與蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接活性中心的保守氨基酸和C端外顯子的第一個氨基酸有關(guān)。內(nèi)含子可以不依賴其他任何因素催化蛋白質(zhì)就可以剪接。

    蛋白質(zhì)順式剪接(cis-splicing)包括4步親核反應(yīng)(圖4)[13-14]。第一步,蛋白質(zhì)內(nèi)含子 N-端的第一個保守氨基酸Cys或Ser引起酰基化重排(acyl rearrangement),N-端蛋白質(zhì)外顯子與蛋白質(zhì)內(nèi)含子之間的肽鍵被打開,形成硫酯鍵或酯鍵。第二步,C-端蛋白質(zhì)外顯子的第一位氨基酸Cys,Ser或Thr的巰基或羥基攻擊第一步反應(yīng)形成的硫酯鍵或酯鍵,導(dǎo)致N-端蛋白質(zhì)外顯子以硫酯鍵或酯鍵連接到C-端蛋白質(zhì)外顯子的第一位氨基酸殘基的側(cè)鏈上。蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N-端剪接點被切斷,形成分支中間體(branched intermediate)。第三步,蛋白質(zhì)內(nèi)含子C-端的Asn或Gln側(cè)鏈上的酰胺基攻擊C-端剪接點的肽鍵,導(dǎo)致該剪接點斷裂。至此,蛋白質(zhì)內(nèi)含子與兩側(cè)的蛋白質(zhì)外顯子分開。第四步,通過自發(fā)的S-N或O-N之間的?;嘏牛瑑蓚€蛋白質(zhì)外顯子之間的硫酯鍵或酯鍵轉(zhuǎn)變成正常的肽鍵。這樣,就完成了標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)。

    斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的反式剪接(trans-splicing)起始于斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子IN和IC的相互識別和結(jié)合。IN和IC緊密結(jié)合后,斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子正確折疊而重建活性中心,之后按照標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)剪接途徑完成蛋白質(zhì)外顯子的連接[15-17]。

    圖4 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接機(jī)制[18]

    2 天然斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子和人工斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子

    2.1 尋找天然斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子

    蛋白質(zhì)反式剪接(trans-splicing)是基于斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的一種剪接方式。斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子分為兩種:一種是天然存在的,另一種是通過基因工程的方法斷裂微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子的方式獲得。1998年,Paul Liu實驗室在藍(lán)藻sp.PCC6803的DnaE蛋白中首次發(fā)現(xiàn)了天然斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子,IN和IC在不同的閱讀框中表達(dá),二者在基因組中相距745226 bp[15]。這種兩段蛋白組成的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子在許多藍(lán)藻中也被發(fā)現(xiàn)[19-20]。天然斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn),暗示了標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子在進(jìn)化中丟失了歸巢內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域,導(dǎo)致兩端的剪接結(jié)構(gòu)域在不同的閱讀框中表達(dá),而且這兩段蛋白可以重新組裝成為有活性的蛋白質(zhì)內(nèi)含子,這為構(gòu)建人工斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子提供了理論依據(jù)。

    2.2 構(gòu)建人工斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子

    歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域的作用是使蛋白質(zhì)內(nèi)含子基因可以在基因組中自由轉(zhuǎn)移,與蛋白質(zhì)剪接功能無關(guān),而且科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)內(nèi)含子去除核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域后也有剪接活性[15,17,21],蛋白質(zhì)內(nèi)含子的晶體結(jié)構(gòu)解析也證明了核酸內(nèi)切酶是獨立的結(jié)構(gòu)域,不參與蛋白質(zhì)剪接[22]。所以科學(xué)家們通過基因工程的方法去除標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子的歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域,并以此為斷裂位點將微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子斷裂,使IN和IC在不同的閱讀框中表達(dá),構(gòu)建了一系列人工斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子[17,23-24]。

    2.3 新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子

    典型蛋白質(zhì)內(nèi)含子去除歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域后,N端有110~130個氨基酸,C端有35~40個氨基酸。在蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)研究中,蛋白質(zhì)內(nèi)含子可以被應(yīng)用于蛋白質(zhì)的半合成。因為現(xiàn)有的多肽合成技術(shù)不能合成多于100aa的多肽,所以只有C端可以通過化學(xué)方法合成,而N端不可以通過化學(xué)合成的方式獲得。

    為了將N端合成多肽也能連接到與其互補(bǔ)的重組表達(dá)蛋白上,Paul Liu實驗室首先在典型斷裂位點(S0)以外設(shè)計了一系列斷裂位點(圖5),其中S0是歸巢核酸內(nèi)切酶的位置,其余大部分?jǐn)嗔盐稽c是在預(yù)測的β-折疊之間的環(huán)狀區(qū)域[25]。通過他們的測試,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子的四個斷裂位點(S1,S6,S7和S8)具有蛋白質(zhì)反式剪接活性。其中S1型的IN只有11個氨基酸,IC有125個氨基酸。隨后,Paul Liu實驗室又驗證了在微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp GyrB中S11斷裂位點處有高剪接活性[26]。S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的IC只有6個氨基酸,IN有150個氨基酸。

    新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子S1和S11的構(gòu)建拓寬了蛋白質(zhì)剪接在蛋白質(zhì)研究和蛋白質(zhì)工程中的應(yīng)用。可以把熒光基團(tuán)、多聚物等化學(xué)修飾分子直接通過合成到化學(xué)合成多肽上,通過反式剪接把帶有蛋白修飾分子的多肽連接到重組蛋白上。新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的構(gòu)建成功,使斷裂位點不再局限于S0位點,為人們設(shè)計斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子拓寬了思路。由于化學(xué)法合成多肽對氨基酸數(shù)目有限制,所以蛋白質(zhì)內(nèi)含子IN和IC的氨基酸數(shù)目越少,那么與IN或IC一同合成的目的蛋白的氨基酸數(shù)目就越多,尋找更小的IN或IC仍然是蛋白質(zhì)內(nèi)含子研究的一個方向。

    圖5 斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子序列中的斷裂位置。154 aa長的微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp DnaB,每隔10個位置空一格排列,選出的13個斷裂位點(S1-S13)用箭頭在上方標(biāo)示,S0是歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域的位置,是典型的斷裂位點。下劃線的是β-折疊(β1-β12)[25]。

    3 蛋白質(zhì)剪接的應(yīng)用

    蛋白質(zhì)剪接的獨特性能是它能將兩個多肽以一個天然肽鍵相連(splicing),為蛋白質(zhì)合成和修飾提供了新的途徑,因而在蛋白質(zhì)工程及其他領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。在蛋白質(zhì)反式剪接中,斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的兩個片段可以分別表達(dá)或合成,每個片段自身不能發(fā)生剪接反應(yīng),只有兩個片段相互識別,重新構(gòu)建活性中心才能發(fā)生反式剪接。蛋白質(zhì)剪接可以應(yīng)用涉及到蛋白質(zhì)化學(xué)修飾、蛋白片段標(biāo)記同位素、蛋白質(zhì)環(huán)化、蛋白芯片、基因治療等領(lǐng)域。

    3.1 蛋白質(zhì)剪接在蛋白質(zhì)化學(xué)修飾中的應(yīng)用

    在蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)研究中,蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾技術(shù)是非常重要的。對蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾的分子可以是熒光基團(tuán)、多聚物、非天然氨基酸、酶的輔基、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的基團(tuán)等?;瘜W(xué)修飾過的蛋白質(zhì)會擁有一些新的性質(zhì):用生物物理探針修飾蛋白質(zhì),可以研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能;用多聚物修飾蛋白質(zhì)藥物,可以增加蛋白藥物的穩(wěn)定性,提高蛋白藥物的利用度等。

    氨基修飾或巰基修飾是常見的化學(xué)修飾方法,但是標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)標(biāo)記方法做不到特異位點標(biāo)記。氨基(N端氨基和Lysε位氨基)在蛋白質(zhì)中的頻率較高,如果一個蛋白質(zhì)中的多個氨基被標(biāo)記,就會出現(xiàn)蛋白沉淀和熒光猝滅。雖然在蛋白質(zhì)中低頻率出現(xiàn)的Cys使飽和修飾成為可能,但是如果Cys在一種蛋白中出現(xiàn)多次或者Cys位于蛋白的活性中心,就不能做到位點特異性標(biāo)記。

    有些新的化學(xué)方法可以進(jìn)行特異位點標(biāo)記,但是這些方法僅限于N端氨基的標(biāo)記,而且還要求蛋白的N端是暴露在外面的,也就是說能否被標(biāo)記還要依賴N端氨基酸殘基的特點[27-29]。有些方法已經(jīng)可以標(biāo)記重組蛋白,但是這些方法存在不足之處,其中有一種方法是用一種配體與多肽標(biāo)簽共價相連,通過配體與重組蛋白的非共價結(jié)合達(dá)到標(biāo)記的目的,這種方法很簡便,但是非共價鍵標(biāo)記不穩(wěn)定,而且多肽標(biāo)簽對目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有影響[30-31]。蛋白質(zhì)反式剪接為蛋白質(zhì)特異位點修飾提供了另一種方法。選擇特定的位點,將目的蛋白斷裂成兩段,分別與IN和IC融合表達(dá)。目的蛋白斷裂位點的選擇根據(jù)蛋白的不同而不同,其中一段目的蛋白只含有一個Cys或Lys。把要標(biāo)記的化學(xué)分子標(biāo)記到Cys或Lys上,再通過蛋白質(zhì)反式剪接將目的蛋白的兩個片段連接在一起[32-34](圖6)。由于S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N端僅含有11個氨基酸,S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C端僅含有6個氨基酸,易于化學(xué)合成,使重組蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端標(biāo)記更加方便??梢詫⒁獦?biāo)記的分子和目的蛋白的片段直接通過化學(xué)合成的方法合成到IN或IC上,通過反式剪接將合成的片段和重組表達(dá)的片段拼接到一起。

    圖6 利用蛋白質(zhì)反式剪接對蛋白質(zhì)進(jìn)行特異位點修飾[35]。第一步,將目的蛋白(protein of interest,POI)斷裂,分別與IN和IC融合表達(dá),與IC融合表達(dá)的片段只含有一個Cys。第二步,將標(biāo)記物選擇性的標(biāo)記到半胱氨酸上。第三步,兩段蛋白發(fā)生反式剪接,形成帶有標(biāo)記物的蛋白。

    3.2 蛋白質(zhì)剪接在NMR中的應(yīng)用

    NMR(nuclear magnetic resonance,核磁共振)技術(shù)是繼x射線晶體衍射技術(shù)后研究蛋白3D結(jié)構(gòu)的又一重大進(jìn)步,這項技術(shù)在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和材料學(xué)中將是至關(guān)重要的。NMR技術(shù)除了可以研究蛋白的3D結(jié)構(gòu)以外,還可以對蛋白的構(gòu)象變化以及蛋白間的相互作用進(jìn)行研究。但是,NMR技術(shù)受限于被檢測蛋白的分子量,原因是分子量增大會造成譜峰重疊,橫向弛豫時間減少(線寬增加)。傳統(tǒng)的NMR技術(shù)很難用于研究溶液和活細(xì)胞中30kDa以上的蛋白質(zhì)。

    對蛋白質(zhì)進(jìn)行片段化同位素標(biāo)記使NMR技術(shù)得到進(jìn)一步的改善,可以檢測更大的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)片段化標(biāo)記的方法有天然化學(xué)連接(NCL)、表達(dá)蛋白連接(EPL)和反式剪接(PTS)等幾種方法。天然化學(xué)連接(NCL)和表達(dá)蛋白連接(EPL)反應(yīng)中包含兩個蛋白,這兩個蛋白分別含有a-thioester和a-Cyseine,a-thioester與a-Cyseine發(fā)生反應(yīng)將兩個蛋白片段連接在一起[36]。

    圖7 利用蛋白質(zhì)反式剪接對蛋白質(zhì)進(jìn)行片段化標(biāo)記同位素[37]。a.含有Tag與IC的質(zhì)粒首先在普通培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)表達(dá)。b.更換含有同位素的培養(yǎng)基后,誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白(protein of interest,POI)與IN。c.在體內(nèi)發(fā)生反式剪接。d.經(jīng)過純化,得到有片段被標(biāo)記的蛋白。

    體內(nèi)(in vivo)反式剪接簡化了標(biāo)記步驟,成功的對多結(jié)構(gòu)域蛋白進(jìn)行片段同位素標(biāo)記[37-38](圖7)。在這種方法中,兩個前體蛋白在同一細(xì)胞內(nèi)兩個不同的質(zhì)粒中表達(dá),兩個質(zhì)粒的誘導(dǎo)方式不一樣。第一個質(zhì)粒在含有同位素的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo),然后把培養(yǎng)基換成不含同位素的培養(yǎng)基,緊接著誘導(dǎo)另一的前體蛋白。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)兩種前體之后,會自發(fā)剪接反應(yīng)。經(jīng)過破碎細(xì)胞和純化,得到片段標(biāo)記的蛋白質(zhì)。Hideo Iwai研究組利用這種方法分別檢測了Src homology結(jié)構(gòu)域和酵母中Sup35p蛋白的3D 結(jié)構(gòu)[37-38]。

    3.3 蛋白質(zhì)剪接在蛋白質(zhì)環(huán)化中的應(yīng)用

    蛋白質(zhì)環(huán)化是指將線性蛋白質(zhì)的N端和C端連接形成環(huán)形蛋白質(zhì)骨架,是設(shè)計新酶和新藥以及研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的新方法。蛋白質(zhì)環(huán)化之后限制了蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化,降低了熵值,環(huán)化后的蛋白質(zhì)有更高的生物活性和更長的藥物半衰期[39]。

    通常利用化學(xué)方法環(huán)化蛋白質(zhì),這些方法包括:在N端和C端氨基酸殘基間形成二硫鍵、肽鍵或是通過連接內(nèi)部氨基酸的側(cè)鏈。但是,這些化學(xué)方法一般只用于較小的蛋白質(zhì),不易應(yīng)用于較大的蛋白質(zhì)環(huán)化[40]。

    Paul Liu和Ming-Qun Xu實驗室利用蛋白質(zhì)反式剪接技術(shù)分別對麥芽糖結(jié)合蛋白(42 kDa),?;d體蛋白(9 kDa)和綠色熒光蛋白(27 kDa)等蛋白進(jìn)行了成功的環(huán)化(圖8)[41-43]。在這種方法中,IN和IC分別與目的蛋白質(zhì)的C末端和N末端融合表達(dá),經(jīng)過蛋白質(zhì)反式剪接之后,目的蛋白的N末端與C末端以肽鍵相連,形成環(huán)形蛋白質(zhì)。

    圖8 利用蛋白質(zhì)反式剪接技術(shù)環(huán)化蛋白質(zhì)[41]。IN和IC分別與目的蛋白(protein of interest,POI)的C末端和N末端融合表達(dá)。經(jīng)過蛋白質(zhì)反式剪接之后,目的蛋白的N末端與C末端以肽鍵相連,形成環(huán)形蛋白質(zhì)。

    3.4 蛋白質(zhì)剪接在基因治療中的應(yīng)用

    在基因治療研究中,由于有些基因治療載體對外源基因的大小有限制,導(dǎo)致分子量大的外源基因不能應(yīng)用到基因治療中。Paul liu實驗室利用蛋白質(zhì)反式剪接成功的解決了這個問題,為基因治療中蛋白表達(dá)提供了新的方法(圖9)[44]。在實驗中,選擇分子量比較大的肌營養(yǎng)不良蛋白基因(dystrophin gene)和腺病毒載體(AAV)。6.3 kb的肌營養(yǎng)不良蛋白基因(dystrophin gene)不能被腺病毒載體(AAV)帶入宿主細(xì)胞。肌營養(yǎng)不良蛋白基因cDNA被斷裂成兩段,并分別與斷裂內(nèi)含子的IN和IC的基因融合表達(dá),將兩段基因克隆到兩個載體中,將兩個載體共轉(zhuǎn)到宿主細(xì)胞中,蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá),通過蛋白質(zhì)反式剪接形成成熟的蛋白,行使基因治療的功能。

    圖9 蛋白質(zhì)反式剪接在基因治療中的應(yīng)用[44]

    3.5 蛋白質(zhì)剪接在其他方面的應(yīng)用

    蛋白質(zhì)反式剪接還可以應(yīng)用到蛋白質(zhì)研究的其他領(lǐng)域。利用反式剪接獲得對宿主細(xì)胞有毒性的蛋白的全長序列,例如I-Tev I核酸內(nèi)切酶[45]和b-amyloid(Ab)[46];可以利用蛋白質(zhì)反式剪接重構(gòu)球蛋白的活性,可以基于這個方法檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[47];利用反式剪接重新構(gòu)建herbicide-resistance蛋白活性,確保轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全性[48];利用蛋白質(zhì)反式剪接把目的蛋白固定到芯片上,應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究[49]。

    4 小結(jié)與展望

    蛋白質(zhì)剪接技術(shù)為蛋白質(zhì)研究和蛋白質(zhì)工程提供了新工具,在蛋白質(zhì)特異位點標(biāo)記、蛋白質(zhì)片段化同位素標(biāo)記、蛋白質(zhì)環(huán)化和基因治療等方面取得了一些成果。另外,蛋白質(zhì)剪接技術(shù)可以應(yīng)用在毒性蛋白的表達(dá)、蛋白質(zhì)相互作用、蛋白固定等方面。新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子在此基礎(chǔ)上擴(kuò)大了斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的應(yīng)用范圍,提供了在目的蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端標(biāo)記任意化學(xué)基團(tuán)的潛力。隨著蛋白質(zhì)剪接技術(shù)的日趨完善,蛋白質(zhì)剪接還會應(yīng)用在蛋白質(zhì)研究的其他領(lǐng)域。

    然而,蛋白質(zhì)剪接技術(shù)還存在一些限制。例如,蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接活性受外顯子的影響,所以會在目的蛋白的斷裂位點插入一些外源氨基酸,這些氨基酸可能會對目的蛋白的結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生影響。所以在設(shè)計目的蛋白的斷裂位點時要充分考慮到這一點。另外,有些人工構(gòu)建的蛋白質(zhì)內(nèi)含子與有些蛋白融合表達(dá)時,會得到很少的可溶性蛋白,要經(jīng)過變復(fù)性才能使蛋白質(zhì)內(nèi)含子有活性。盡管有這些限制,蛋白質(zhì)剪接技術(shù)還是應(yīng)用到了蛋白質(zhì)研究與蛋白質(zhì)工程的很多領(lǐng)域。

    (2011年9月30日收到)

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