幽門螺桿菌重組Bb－h(huán)paA－vacA疫苗的構(gòu)建＊

王國(guó)富，高 峰，吳利先

幽門螺桿菌重組Bb－h(huán)paA－vacA疫苗的構(gòu)建＊

王國(guó)富，高 峰，吳利先

目的構(gòu)建幽門螺桿菌（Hp）重組雙歧桿菌（Bb）Bb－h(huán)pa A－vac A疫苗。方法通過PCR分別擴(kuò)增hpa A和vac A抗原編碼基因，然后采用基因拼接法（gene SOEing）剪接hpa A和vac A，得到hpa A－vac A融合基因；將該融合基因定向克隆到大腸埃希菌－雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體pGEX－1λT，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX－h(huán)paA－vac A，電穿孔法將該質(zhì)粒導(dǎo)入Bb，構(gòu)建幽門螺桿菌重組hpa A－vac A疫苗，然后用SDS－PAGE和Western blotting鑒定表達(dá)的重組蛋白。結(jié)果PCR成功擴(kuò)增出分子量約為1 500 bp的hpaA－vac A融合基因，雙酶切證實(shí)hpa A－vac A融合基因成功插入pGEX－1λT中，并成功轉(zhuǎn)化入雙歧桿菌，而且重組蛋白能在雙岐桿菌中得到正確表達(dá)，Western blotting顯示重組蛋白具有免疫原性。結(jié)論成功構(gòu)建螺桿菌rBbhpa A－vac A疫苗，為該疫苗的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

幽門螺桿菌；雙歧桿菌；重組hpaA－vac A疫苗；構(gòu)建

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）能夠引起慢性、活動(dòng)性胃炎和消化性潰瘍，同時(shí)它也是胃腫瘤的危險(xiǎn)因素，并已被世界衛(wèi)生組織列為胃癌等腫瘤發(fā)生的相關(guān)致病菌［1－2］。Hp在我國(guó)普通人群的感染率約為50%～80%，并仍以每年1%～2%速度增加［3］。如何根治Hp的感染一直是微生物學(xué)和消化疾病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。Hp在胃內(nèi)定植的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是粘附，是感染的先決條件和致病的關(guān)鍵。Hp粘附素基因hpa A（Helicobacter pylori adhesin A，hpa A）較保守，為Hp所特有，其編碼蛋白Hpa A具有粘膜結(jié)合特性，并有良好的抗原性和免疫原性［4］。空泡毒素（Vacuolating cytotoxin A，Vac A）可誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡在Hp致病過程中起著重要作用。而且Vac A在菌株中的表達(dá)率與臨床發(fā)病率非常相符［5］，因此Vac A預(yù)防措施顯得尤為重要。

雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum，Bb）是一種常見的益生菌，近年來除對(duì)雙歧菌的益生功能進(jìn)一步深入研究外，利用該菌作為基因工程受體菌的研究也越來越受重視。與大腸桿菌等宿主相比，雙岐桿菌等益生菌作為基因工程受體菌具有特殊的意義，其除能發(fā)揮原有的益生功能外，還能發(fā)揮佐劑功能。因此構(gòu)建重組Bb－vac A－h(huán)pa A融合基因疫苗具有相當(dāng)可觀的前景。

1 材料與方法

1．1 菌種與質(zhì)粒 兩歧雙歧桿菌Bb購(gòu)自武漢大學(xué)菌種保存中心，大腸桿菌－雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體p GEX－1λT由李文桂教授惠贈(zèng)，質(zhì)粒p QE－h(huán)pa A［6］、p QE－vac A［7］、大腸桿菌BL21由本室保存。

1．2 主要試劑 PCR試劑、高效感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒（SK9305）購(gòu)自上海生物工程公司。內(nèi)切酶、純化試劑盒和DNA連接試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程公司。NC膜及HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自北京晨綠生物技術(shù)公司。幽門螺桿菌兔抗vac A免疫血清和兔抗hpa A免疫血清由本室制備并保存。

1．3 hpaA－vac A融合基因的擴(kuò)增 參照 Gene Bank中的hpa A和vac A基因序列設(shè)計(jì)引物，vac A的上游引物 P1：5′－GCGGATCCATGCATTATTGGGTCAAAG－3′，下游引物P2：5＇－ATGGTACCTTACTATCTTGTTT－3′；hpa A 上 游 引 物 P3：5′－CGGGTACCATGAGAGC AAATAAT－3′，下游引物 P4：5′－CGGTCGACTTCTTATGCGTTATTTG －3′；分別以p QE－vac A和p QE－h(huán)pa A 為模板擴(kuò)增vac A和hpaA基因。再設(shè)計(jì)引物P5和P6，引入vac A Lingker和hpa A Lingker（IL－3的12個(gè)氨基酸的接頭）。分別以PCR擴(kuò)增出的vac A和hpaA基因?yàn)槟０?，P1、P5和P4、P6為引物分別擴(kuò)增出帶Lingker的vac A和hpa A基因。最后再以帶Lingker的vac A和hpa A基因的PCR混合物為模板，以P1和P4為引物擴(kuò)增出hpa A－vac A融合基因（在hpa A與vac A的融合基因之間有IL－3的12個(gè)氨基酸的36個(gè)堿基接頭CAGGAGCAGGACGGGCAGGCGGCTCATGTTTGGATC進(jìn)行連接）。1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1．4 重組質(zhì)粒p GEX－h(huán)pa A－vac A的構(gòu)建和鑒定

質(zhì)粒p GEX－1λT和hpa A－vac A融合基因的PCR產(chǎn)物分別用BHam HI和Eco RI進(jìn)行雙酶切后純化，將各自純化后的產(chǎn)物用T4連接試劑盒16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞。LA培養(yǎng)基篩選后，挑取陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和限制性酶切鑒定。鑒定正確后送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

1．5 幽門螺桿菌重組Bb－vac A－h(huán)pa A疫苗的構(gòu)建和鑒定

1．5．1 Bb電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備［8］取生長(zhǎng)良好的Bb 1 m L加至100 m L含0．5 mol／L蔗糖的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24～72 h，冰浴2．5 h，期間搖晃懸浮菌體。4℃5 000 r／min離心10 min，棄上清，依次用預(yù)冷的10%甘油50 m L、25 m L、10 m L 4℃離心進(jìn)行洗滌，最后棄上清，加入預(yù)冷的10%甘油1．5 m L，充分懸浮菌體，取50μL準(zhǔn)備電擊轉(zhuǎn)化，剩余感受態(tài)細(xì)胞－70℃保存。

1．5．2 重組質(zhì)粒p GEX－h(huán)paA－vac A的電轉(zhuǎn)化 取50μL Bb感受態(tài)細(xì)菌加至含20μL重組質(zhì)粒p GEX－h(huán)pa A－vac A的Ep管，混勻，冰浴1 min后轉(zhuǎn)移至電穿孔杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。參數(shù)設(shè)置為：電壓為1．5 k V、轉(zhuǎn)化時(shí)間為5 ms、轉(zhuǎn)化次數(shù)為3次，轉(zhuǎn)化完畢后立刻加入1 m L含0．5 mol／L蔗糖的MRS液體培養(yǎng)基，輕輕移入10 m L培養(yǎng)管中，37℃100 r／min厭氧培養(yǎng)2 h。將培養(yǎng)管中細(xì)菌培養(yǎng)液吸至1．5 m L Ep管，3 000 r／min離心5 min，棄大部分上清，將剩余的100μL培養(yǎng)液懸浮，涂于含50μg／m L氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，待吸收后置37℃倒置厭氧培養(yǎng)24～72 h。

1．5．3 重組Bb疫苗的鑒定 挑取上述篩選培養(yǎng)基上單個(gè)菌落至100 m L含0．5 mol／L 蔗糖的MRS液體培養(yǎng)基中，加入10μg／μL氨芐青霉素500μL，37℃厭氧培養(yǎng)24～72 h，提取質(zhì)粒后，PCR擴(kuò)增hpa A－vac A融合基因及對(duì)重組質(zhì)粒限制性酶切分析鑒定。

1．5．4 p GEX－h(huán)pa A－vac A 在雙歧桿菌中的表達(dá)及Western blot分析 挑取陽性轉(zhuǎn)化菌單菌落接種于100 m L MRS液體培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)48h后收獲菌體，菌體破壁后進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物。觀察表達(dá)條帶并用Western blot分析鑒定重組蛋白。具體為將上述SDS－PAGE電泳的凝膠移至硝酸纖維膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2h，PBST震洗3次，分別加入一抗兔抗Vca A血清和兔抗Hpa A抗血清作用2 h，震洗3次，再加入二抗羊抗兔IgG作用2h，震洗后顯色。步驟同大腸桿菌。

2 結(jié) 果

2．1 hpa A和vac A抗原編碼基因以及hpa A－vac A融合基因的擴(kuò)增 以p QE－vac A和p QE－h(huán)pa A為模板，分別以P1、P2和P3、P4為引物擴(kuò)增vac A（723 bp）和hpa A（783 bp）基因，均在750 bp附近出現(xiàn)了明顯條帶，大小與預(yù)計(jì)相符，見圖1。通過基因拼接，并以P1和P4為引物擴(kuò)增出中間帶有Lingker的hpaA－vac A融合基因，在1 500 bp左右出現(xiàn)了條帶，結(jié)果也與預(yù)計(jì)相符，見圖2。

2．2 重組質(zhì)粒pGEX－h(huán)pa A－vac A的鑒定和融合基因的測(cè)序 將轉(zhuǎn)化后在LA平板上生長(zhǎng)的BL21陽性克隆接種于液體培養(yǎng)基過夜后，提取質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切和PCR鑒定，均得到了與預(yù)計(jì)相符的條帶，見圖3。鑒定正確后的陽性克隆測(cè)序結(jié)果與GeneBank中序列相符。說明重組質(zhì)粒p GEX－vac A－h(huán)pa A構(gòu)建成功。

2．3 rBb－vac A－h(huán)pa A疫苗的鑒定 通過電轉(zhuǎn)化Bb后，以從具有AMP抗性的r Bb中提取質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切和PCR鑒定。結(jié)果與上述圖3一致，PCR擴(kuò)增出了1 500 bp大小的條帶，限制性酶切后得到了與PCR大小相符的片段，說明r Bb－vac A－h(huán)pa A疫苗構(gòu)建成功。

2．4 pGEX－h(huán)pa A－vac A 在雙歧桿菌中的表達(dá)和Western blotting分析 重組質(zhì)粒在雙岐桿菌能得到正確表達(dá)，但產(chǎn)量不高，約占細(xì)菌總蛋白的8．5%見圖4。經(jīng) Western blotting分析，能分別與兔抗Vca A血清和兔抗HpaA抗血清作用而免疫著色見圖5，說明重組融合蛋白兼具有兩種單獨(dú)蛋白的免疫活性。

3 討 論

Hp與多種胃腸道炎癥相關(guān)，而且在我國(guó)感染率非常高。隨著對(duì)Hp致病機(jī)理及其基因組結(jié)構(gòu)與功能認(rèn)識(shí)的逐步深入，免疫療法被認(rèn)為是防治Hp感染最有效最有前景的方法之一。由于雙價(jià)Hp基因工程疫苗免疫保護(hù)效果優(yōu)于單價(jià)疫苗，因此研究多價(jià)疫苗及其抗原組合將是Hp疫苗研制的主要方向。

圖5 重組蛋白Vac A－HpaA的Western blotting鑒定1，4：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，5：陰性對(duì)照；3：所表達(dá)蛋白與兔抗Vac A血清反應(yīng)的結(jié)果；6：所表達(dá)蛋白與兔抗Hpa A血清反應(yīng)的結(jié)果Fig．5 Recombinant protein VacA－HpaA identified by Western blot 1，4：Protein marker；2，5：Control；3：Recombinant protein responsed with the anti－Vac A serum；6：Recombinant protein responsed with the anti－Hpa A serum

病原體的特異性粘附由粘附素－受體系統(tǒng)介導(dǎo)，依賴于粘附分子上某些特定的氨基酸位點(diǎn)與受體的結(jié)合。有研究證實(shí)，Hp粘附素基因hpa A（Helicobacter pylori adhesin A，hpa A）較保守，為Hp所特有，其編碼蛋白Hpa A具有粘膜結(jié)合特性，并有良好的抗原性和免疫原性［4］。Elisabet等［9］通過構(gòu)建了Hp的hpa A基因敲除突變株，進(jìn)一步在小鼠感染模型中證實(shí)了Hpa A在Hp定植中的必要性。

1988年，Leunk發(fā)現(xiàn)了Hp能使真核細(xì)胞空泡變性的毒素，并命名為空泡毒素（Vacuolating cytotoxin A，Vac A）。國(guó)內(nèi)外大量研究證明，Vac A加入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中，數(shù)小時(shí)后能夠引起細(xì)胞空泡樣變，3～4d后，細(xì)胞變性與死亡。已有研究顯示天然的Vac A和重組Vac A均可誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡在 Hp致病過程中起著重要作用［5］。此外，相較于Hp其他的毒力因子，Vac A在菌株中的表達(dá)率與臨床發(fā)病率非常相符，因此Vac A預(yù)防措施顯得尤為重要。其中編碼蛋白質(zhì)37k D亞單位的基因片段又相對(duì)保守，這就為針對(duì)Vac A疫苗的研制提供了有力條件。

雙歧桿菌是人和哺乳動(dòng)物回腸末端及大腸內(nèi)最主要的生理性菌群，是一種益生菌。重組雙歧桿菌疫苗具有下述優(yōu)點(diǎn)：所表達(dá)的靶基因不需純化，可直接用于免疫接種，免去了蛋白質(zhì)后處理的復(fù)雜工序；單次接種即可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的免疫反應(yīng)，而且具有粘膜佐劑的作用；運(yùn)用分子生物學(xué)手段，通過對(duì)不同靶抗原的剪切和拼接，可使新型疫苗理想化；雙歧桿菌本身作為一種益生菌，對(duì)胃粘膜有保護(hù)作用，還可提高宿主的免疫力；它價(jià)格低廉，適于大量生產(chǎn)，更容易被接受和認(rèn)可。因此構(gòu)建vac A－h(huán)pa A融合基因疫苗，用雙歧桿菌作為載體口服導(dǎo)入機(jī)體表達(dá)目的基因，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，既可阻止Hp的粘附，又可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體發(fā)揮全身免疫應(yīng)答。

為了將外源性DNA有效引入雙歧桿菌，需要構(gòu)建大腸桿菌－雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體。本研究所采用的大腸桿菌－雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體p GEX－1λT含有雙歧桿菌復(fù)制起點(diǎn)、大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)多克隆位點(diǎn)和一個(gè)氨芐青霉素抗性基因。上游有一個(gè)啟動(dòng)子Ptac（trp操縱子啟動(dòng)子與lac操縱子啟動(dòng)子的融合啟動(dòng)子），在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)。這種穿梭載體可允許外源性DNA在大腸桿菌中操作，鑒定正確后再轉(zhuǎn)化入雙歧桿菌，通過自動(dòng)復(fù)制或同源整合與基因組進(jìn)行基因交換，從而在雙歧桿菌中穩(wěn)定表達(dá)外源性基因［8］。本研究構(gòu)建大腸桿菌重組質(zhì)粒p GEX－h(huán)pa A－vac A在雙歧桿菌中也得到了正確表達(dá)，但表達(dá)量只有全菌蛋白的8．5%。雖然表達(dá)量低，但也表明了雙岐桿菌是能夠同時(shí)發(fā)揮其益生菌和表達(dá)外源基因的雙重作用的。今后研究的重點(diǎn)是對(duì)雙歧桿菌分子生物學(xué)的深入探討，提高載體的表達(dá)能力。

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Construction of recombinant Bb－h(huán)paA－vacA vaccine of Helicobacter pylori

WANG Guo－fu，GAO Feng，WU Li－xian
（Department Microbiology，Basic Medical School，Dali College，Dali 671000，China）

To construct the recombinant Bb－h(huán)pa A－vac A vaccine of Helicobacter pylori，hpa A and vac A antigen genes were amplified by PCR and the fusion gene hpa A－vac A was obtained with gene SOEing．Then the fusion gene was cloned into Escherichia coli－Bifidobacteria shuttle plasmid p GEX－1λT to construct p GEX－h(huán)pa A－vac A．The recombinant plasmid was electroporated into Bifidobacteria bifidum （Bb）to construct rBb hpa A－vac A vaccine．The recombinant protein was analyzed by SDS－PAGE．Its immunogenicity was identified by Western blotting．A 1500bp fusion gene of hpa A－vac A was successfully amplified by PCR and cloned into pGEX－1λT by restriction analysis，and the rBb hpa A－vac A vaccine was successfully constructed by PCR and restriction analysis．The recombinant protein could be expressed in B．bifidium and it has immunogenicity．In this way，the r Bb hpa A－vac A vaccine of Helicobacter pylori is successfully constructed，which lays the experimental foundation of exploitation and utilization of this vaccine．

Helicobacter pylori；Bifidobacterium bifidum；recombinant hpa A－vac A vaccine；construction

R378

A

1002－2694（2012）02－0131－04

＊云南省自然科學(xué)基金（2007C147 M）資助

吳利先，Email：w＿lixian＠163．com；

云南省大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，大理671000

2011－06－02；

2011－09－15