猴B病毒gB基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)＊

段博芳，王 瓊，段 綱，毛永楊，葉玲玲，楊建明，徐維加，董 俊，周曉黎，艾 軍

B病毒又稱為猴皰疹病毒、皰疹B、猴B病毒以及B皰疹病毒，由于其名稱繁多，國際病毒分類命名委員會將其稱為猴皰疹病毒I型（cercopithecine herpesvirus1），它屬于皰疹病毒科，a皰疹病毒亞科的單純皰疹病毒屬［1］。B病毒為雙鏈DNA病毒，有囊膜，直徑160～180mm大小，有多個開放閱讀框，其中的一些氨基酸序列與引起人口腔潰瘍的HSV－1和人生殖器皰疹的HSV－2約有79%的同源性［2］，具有血清學(xué)交叉反應(yīng)。B病毒作為一種人獸共患病，可感染許多哺乳動物和禽類以及人類，此病毒的自然宿主主要是獼猴科，其種類超過16種，這些猴類絕大多數(shù)存在于亞洲。猴通常在2～4歲性成熟期間被感染，隨著年齡增長血清中抗體陽性比率逐漸增加，成年猴可達(dá)80%～100%［3］。猴被感染后一般終生攜帶病毒，但不表現(xiàn)或很少表現(xiàn)出臨床癥狀［4］。

全球存在已超過43例人感染B病毒的病例，2／3集中在美國，其他分布在英國和加拿大［5］。大多數(shù)病例都與猴直接接觸有關(guān)，如抓傷，咬傷或者黏膜接觸了猴子的體液或是分泌物［5］。人與人之間的傳播到目前為止僅有一例病例［6］，經(jīng)調(diào)查人體感染B病毒后進(jìn)行二次傳染的概率極低［7］。

中國是世界上少數(shù)幾個靈長類動物資源豐富的國家之一，隨著生物醫(yī)藥科技的發(fā)展，靈長類動物作為理想的實(shí)驗(yàn)動物模型研究越來越多，SPF級猴在進(jìn)出口和科研需要中日漸突顯，B病毒的存在不僅影響猴群的生存質(zhì)量，而且威脅實(shí)驗(yàn)人員和飼養(yǎng)人員的健康。因此，無論從建立合格的靈長類實(shí)驗(yàn)動物種群考慮，或是進(jìn)出口安全，或是人類健康考慮，研究開發(fā)安全高效適合大量猴群和鑒別HSV感染的B病毒檢測方法，并將其用于B病毒感染的早期和快速診斷有著重要意義。本研究利用人工合成的gB基因，在昆蟲細(xì)胞上進(jìn)行了表達(dá)，初步獲得了表達(dá)的gB蛋白，為下一步以表達(dá)的gB蛋白為診斷抗原，替代現(xiàn)階段以病毒作為抗原的猴B病毒ELISA檢測試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 質(zhì)粒和菌種 pBluescript SK－gB重組質(zhì)粒（攜帶人工合成的猴B病毒gB基因），其中g(shù)B基因參照序列來自GenBank（B病毒E2490株登錄號：AF533768），由大連寶生物工程有限公司合成攜帶增強(qiáng)表達(dá)序列的 AF533768全序列。pFast－BacHTA質(zhì)粒、E．coil．Top10和DH10BAC菌株，為云南出入境檢驗(yàn)檢疫局動檢實(shí)驗(yàn)室保存。

1．2 主要的試劑和儀器 質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購于Axygen公司，限制性內(nèi)切酶EcoRI和 XbaI、DNA Marker、T4連接酶 購于TaKaRa公司；Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司；胎牛血清、Grace’s細(xì)胞培養(yǎng)基購自GBICO公司；抗HIS單抗購自天根生化科技有限公司，羊抗猴IgG／辣根酶（HRP）標(biāo)記抗體、山羊抗小鼠IgG／辣根酶（HRP）標(biāo)記抗體購自SouthernBiotech公司，鼠抗HSV2gB FITC二抗購自Abcam；PCR儀購自Eppondoff。其他試劑及儀器均為商業(yè)公司購買。

1．3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)B病毒E2490株堿基序列設(shè)計(jì)了一對引物用于鑒定GB基因，PB1：5′－ACCACCgACCTgAAgTACAACC－3′；PB2：5′－Cg－CAgCATCTCgTCCACCT－3′；目的片段擴(kuò)增長度為386bp。參照Bac－to－Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)使用手冊，設(shè)計(jì)用于鑒定DH10Bac桿粒通用引物（M13）， M13Forward：5′－GTTTTCCCAGTCACGAC－3′；M13Reverse：5′－CAGGAAACAGCTATGAC－3′；擴(kuò)增片段長度為4．5kb。引物均由Invitrogen公司合成。

1．4 目的基因鑒定 用設(shè)計(jì)的特異性引物PB1／PB2對重組質(zhì)粒pBluescript SK－gB進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃3min；94℃，30s，55．5℃30s，72℃40s，共30個循環(huán)；72℃7min；4℃ 保溫。反應(yīng)結(jié)束后，1．0% 瓊脂糖凝膠電泳120v30 min，鑒定擴(kuò)增結(jié)果。同時用重組質(zhì)粒用EcoRI和XbaI雙酶切鑒定。

1．5 pFastBac－HTa－gB 重 組 質(zhì) 粒 的 構(gòu) 建 用EcoRI和XbaI酶切pBluescript SK－gB重組質(zhì)粒，回收gB片段，與經(jīng)過相同處理的pFastBac－HTa相連。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切和測序鑒定。

1．6 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 將陽性質(zhì)粒pFastBac－HTa－gB的轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭載體的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體，通過卡那霉素、四環(huán)素和慶大霉素篩選重組轉(zhuǎn)座子bacmid－gB，提取桿粒，分別用M13引物和gB引物進(jìn)行PCR鑒定。

1．7 重組gB蛋白表達(dá)的免疫熒光檢測 按照Invitrogen Bac－to－Bac Baculovirus Expression System使用說明手冊進(jìn)行，將重組轉(zhuǎn)座子bacmid－gB的DNA在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染對數(shù)期生長的sf9昆蟲細(xì)胞。盲傳至第3代后，以載玻片為載體，28℃培養(yǎng)96h后，固定細(xì)胞，滴加gB抗體猴血清，37℃感作1h，吸去一抗，用TBS沖洗3次，自然干燥。在黑暗無光線處，滴加FITC標(biāo)記的鼠抗HSV2gB FITC二抗，熒光顯微鏡下進(jìn)行g(shù)B蛋白免疫熒光檢測。

1．8 重組表達(dá)蛋白的SDS－PAGE和 Western blot分析 取重組病毒感染細(xì)胞裂解物上清用12%的分離膠進(jìn)行SDS－PAGE。將電泳后的凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)印硝酸纖維膜，A組：一抗為抗His標(biāo)記的小鼠抗體（1∶3 000），二抗為抗鼠IgG／辣根酶（HRP）標(biāo)記（1∶3 000），以正常細(xì)胞上清為陰性對照，按常規(guī)步驟做Western blot。B組：一抗為gB抗體陽性猴血清（1∶10），二抗為羊抗猴IgG／辣根酶（HRP）標(biāo)記（1∶3 000），按常規(guī)步驟做 Western blot。

2 結(jié) 果

2．1 目的基因鑒定 用引物PB1／PB2對重組質(zhì)粒pBluescript SK－gB進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為386bp（見圖1），雙酶切（見圖2）pBluescript SK－gB中出現(xiàn)兩條帶起大小分別為2 900bp、2 000bp（見圖2，泳道2）；pFastBac－HTa出現(xiàn)兩條帶其大小分別為：4 756bp、100bp（見圖2，泳道1），均與理論值相符。

2．2 重組質(zhì)粒pFastBac－HTa－gB的鑒定 重組質(zhì)粒pBluescript SK－gB和 質(zhì) 粒pFastBacHTA 經(jīng)EcoRI和XbaI酶切處理后，連接，轉(zhuǎn)化構(gòu)建的重組質(zhì)粒pFastBac－HTa－gB。用引物 PB1／PB2對其進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物為386bp，與理論值相符。經(jīng)EcoRI和XbaI雙酶切，酶切產(chǎn)物分別為6 100bp和2 100bp（見圖3，泳道1），均與理論值相符。經(jīng)測序進(jìn)一步序列分析驗(yàn)證插入的基因含有B病毒gB基因的完整開放閱讀框架，并且序列正確。鑒定結(jié)果表明：成功構(gòu)建了昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pFastBac－HTa－gB。

圖3 pFastBac－HTa－gB酶切鑒定Fig．3 Identification of pFastBac－HTa－gB by enzyme digestion 1：XbaⅠ＆EcoRⅠenzyme digestion 2：EcoRⅠenzyme digestion；M：DL7000DNA Marker

2．3 轉(zhuǎn)座桿粒的PCR鑒定 pFastBac－HTa－gB轉(zhuǎn)入DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素抗生素平皿篩選后，提取其DNA，用M13正向和反向引物進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物為4 330 bp，見圖4（泳道1，2）表明獲得了轉(zhuǎn)座的桿粒。未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的DH10Bac菌株擴(kuò)增出330bp的目的條帶，見圖4（泳道3），表明GB基因已經(jīng)轉(zhuǎn)座成功。

圖4 gB基因桿狀病毒表達(dá)載體的PCR鑒定Fig．4 Amplification the baculovirus expression vector to simian B virus gB gene by PCR1，2：Amplified product of the baculovirus expression vector to simian B virus gB gene by PCR；3：Amplified product of DH10Bac；4：Negative；M1：DL2000 DNA Marker；M2：DL7000DNA Marker

2．4 重組蛋白在昆蟲細(xì)胞中表達(dá) 提取轉(zhuǎn)座桿粒DNA，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染對數(shù)期生長的轉(zhuǎn)染sf－9昆蟲細(xì)胞，28℃培養(yǎng)96h后，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，鏡下可見熒光蛋白轉(zhuǎn)染對照組發(fā)出明亮的綠色熒光（見圖5B），重組bacmid轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)

圖5 重組蛋白在sf－9昆蟲細(xì)胞上表達(dá)（10×16）Fig．5 Expression of recombination protein in sf－9cellA：Normal sf－9cell；B：Transfection bacmid－GFP rod granule in sf－9cell；C：Transfection bacmid－GB rod granule in sf－9cell

2．5 重組gB蛋白表達(dá)的免疫熒光檢測 提取轉(zhuǎn)座桿粒DNA，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染對數(shù)期生長的轉(zhuǎn)染sf－9昆蟲細(xì)胞，并經(jīng)過PCR檢測確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后，按1．7方法進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，鏡下顯示：轉(zhuǎn)染bacmid空桿粒的昆蟲細(xì)胞無任何熒光（見圖6A），轉(zhuǎn)染bacmid－gB重組桿粒的昆蟲細(xì)胞胞漿可見明顯黃綠色熒光（見圖6B），結(jié)果表明重組gB蛋白表達(dá)成功。

圖6 間接免疫熒光試驗(yàn)檢測sf－9細(xì)胞（10×20）Fig．6 Detection of pVax1－Mx1infected sf－9cells by indirect PCRA：Transfection bacmid rod granule in sf－9cell；B：Transfection bacmid－NP rod granule in sf－9cell

2．6 重組表達(dá)蛋白的SDS－PAGE和 Western blot將重組病毒感染細(xì)胞裂解上清用12%的分離膠進(jìn)行SDS－PAGE，結(jié)果在約98kDa左右可見表達(dá)產(chǎn)物，和預(yù)期大小一致（見圖7泳道1）。A組和B組Western blot檢測，均在約98kDa處出現(xiàn)特異性印跡，而正常細(xì)胞上清中在此位置沒有出現(xiàn)特異性印跡（見圖8A、8B）。

3 討 論

圖7 gB重組蛋白SDS－PAGE分析Fig．7 SDS－PAGE analysis of recombinant protein GB1：Sf9cells infected by recombinant baculovirusGB；2：Sf9cells infected by recombinant baculovirus GFP；3：Normal Sf9cellsM：Molecular weight marker of protein

B病毒（猴皰疹病毒I型）屬于生物安全四級病原微生物，它的培養(yǎng)最低要求BSL－3設(shè)施［8］。B病毒的分離培養(yǎng)是感染的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法，同時也是對B病毒的臨床樣品定量檢測的唯一方法，但此病毒的培養(yǎng)需在P4實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。使用PCR的方法雖然靈敏、快速，但PCR只能檢測病毒核酸，并不能確定樣品中是否存在感染性病毒。目前使用的血清學(xué)檢方法中的BVEIA，及ELISA法由于其商品化產(chǎn)品一般采用的是全病毒或類似HSV病毒來制備抗原，其病原需要進(jìn)行滅活處理，涉及到操作人員的安全問題。

病毒囊膜上的糖蛋白在病毒粘附并進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程中起到非常重要的作用。在HSV中，已知有11種糖蛋白分別是gB，gC，gD，gE，gG，gH，gI，gY，gL，gN及gM，其中有9種存在于B病毒中［9］。據(jù)Perelygina等［10］報(bào)道，在B病毒的9種糖蛋白中，用于B病毒診斷的敏感性gB、gC、gD分別為100%、97．3%、88%。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果充分反應(yīng)出了B病毒gB基因具有高度的保守性和特異性，可以使用B病毒gB基因克隆表達(dá)蛋白，取代全病毒作為抗原的ELISA方法，改善目前所使用ELISA檢測方法中，活病毒操作中危險(xiǎn)人類安全的問題。為了能獲得安全可靠的抗原，本研究從三方面進(jìn)行了考慮。首先，選擇敏感性好、特異性高的gB蛋白作為表達(dá)的目的蛋白；其次，選擇真核表達(dá)系統(tǒng)之一的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，此系統(tǒng)方便快捷并能保證表達(dá)蛋白的忠實(shí)性和生物活性；最后，為了保證PCR擴(kuò)增的忠實(shí)性，選用了既有高保真度又有校正功能的TakaRaLA Taq高保真酶。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，使用M13引物鑒定目的片段時，除了目的片段在約300bp的位置亦可見明顯條帶，這是因?yàn)锽acmid含有1個低拷貝量的小F復(fù)制子，一個比Marker（DNA）片段的1kb片段遷移慢得多的條帶（＞135kb）的出現(xiàn)指示bacmid種類的存在，但還有其他大小的雜帶出現(xiàn)。M13引物對準(zhǔn)bacmid互補(bǔ)區(qū)域內(nèi)的?。璦ttTn7位點(diǎn)兩邊的序列，它們的PCR產(chǎn)物大小約為300bp，能更準(zhǔn)確地驗(yàn)證Bacmid。另外，從轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞結(jié)果來看，轉(zhuǎn)染了gB桿粒的細(xì)胞變大、變圓、細(xì)胞核擴(kuò)大，這與國內(nèi)外學(xué)者的報(bào)道相符［11－13］；而設(shè)立的熒光蛋白對照能見熒光但細(xì)胞形態(tài)無可見變化，之所以會出現(xiàn)這樣的差異，推測這可能與插入表達(dá)載體的片段大小，或是轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后重組蛋白本身的特性和蛋白適應(yīng)細(xì)胞生長能力不同有關(guān)。

［1］Huss JL，Barry PA．B－virus（Cercopithecine herpesvirus 1）infection in humans and macaques：potential for zoonotic desease［J］．Emerg Infect Dis，2003，9（2）：246－250．DOI：10．3201／eid0902．020272

［2］Emerel R，Hilliard J．The simian herpesviruses［J］．Infect A－gents Dis，1995，4（2）：55－70．

［3］Holmes GP，Chapman LE，Stewart JA，et al．Guidelines for the prevention and treatment of B－virus infections in exposed persons．The B virus Working Group［J］．Clin Infelt Dis，1995，20（2）：421－439．DOI：10．1093／clinids／20．2．421

［4］Weigler BJ，Hird DW，Hilliard JK，et al．Epidemiology of cercopithecine herpesvirus 1（B virus）infection and shedding in a large breeding cohort of rhesus macaques［J］．J Infect Dis，1993，167（2）：257－263．DOI：10．1093／infdis／167．2．257

［5］Centers for Disease Control and Prevention．Fatal Cercopithecine herpesvirus 1（B virus）infection following a mucocutaneous exposure，and interim recommendations for worker protection［J］．MMWR Morb Mortal Wkly Rep，1998，47（49）：1073－1076．

［6］Centers for Disease Control and Prevention．B－virus infection in humans－Pensacola，F(xiàn)lorida［J］．MMWR Morb Mortal Wkly Rep，1987，36（19）：289－290，295－296．

［7］Holmes GP，Hilliard JK，Klontz KC，et al．B virus（Herpesvirus simiae）infection in humans：epidemiologic investigation of a cluster［J］．Ann Intern Med，1990，112（11）：833－839．

［8］U．S．Department of Health and Human services，PHS．Centers for Disease Control and Prevention，National Institutes of Health．Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories［M］．4thedition．Washington（Dc）：U．S．Government printing office，1999．

［9］Ohsawa K，Black DH，Sato H，et al．Sequence and genetic arrangement of the U（S）region of the monkey B virus（cercopithecine herpesvirus 1）genome and comparison with U（S）region of other primate herpesviruses［J］．J Virol，2002，76（3）：1516－1520．DOI：10．1128／JVI．76．3．1516－1520．2002

［10］Ludmilaperelygina，Irina Patru sheua，etal．Production of herpes of B virus recombinant glycoproteins and evaluation of their diagnostic potential［J］．J Clin Microbiol，2005，43（2）：620－628．DOI：10．1128／JCM．43．2．620－628．2005

［11］Li ZJ，Yao GH，Liu JH ，et al．Expression of SARS coronavirus S protein in insect cells and its purification［J］，Chin J Virol，2005（4）：303－304．（in Chinese）李志杰，要國華，劉靖華等，SARS冠狀病毒S蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)和純化［J］，病毒學(xué)報(bào)，2005，21（4）：303－304．

［12］Shafer AL，Katz JB，Eernisse KA．Development and validation of a competitive enzyme－linked immunosorbent assay for detection of type A influenza antibodies in avian sera［J］．Avian Dis，1998，42（1）：28－34．

［13］Starick E，Werner O，Schirrmeier H，et al．Establishment of a competitive ELISA （cELISA）system for the detection of influenza A virus nucleoprotein antibodies and its application to field sera from different species［J］．J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health，2006，53（8）：370－375．DOI：10．1111／j．1439－0450．2006．01007．x