熱致死發(fā)酵乳桿菌對牛乳β-乳球蛋白過敏小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用①

李艾黎 孟祥晨 徐 漸 邵 紅 馬冬雪

(乳品科學(xué)教育部重點實驗室 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030)

牛乳營養(yǎng)豐富，是嬰幼兒重要的食物蛋白來源。但據(jù)國外流行病學(xué)調(diào)查表明，2% ～6%的兒童對牛乳產(chǎn)生過敏反應(yīng)，嚴(yán)重影響其對優(yōu)質(zhì)乳蛋白的吸收利用。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，BLG)被視為最主要的牛乳過敏原蛋白之一，主要誘發(fā)特異性IgE抗體介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)，可引起嘔吐、腹痛和腹瀉等胃腸不適［1，2］。且過敏引起的胃腸道疾病(如嬰幼兒結(jié)腸炎)常致兒童生長遲緩［3，4］。如何減少 β-乳球蛋白所致牛乳過敏癥已成為現(xiàn)代乳制品生產(chǎn)中急待解決的問題。

近年來，許多研究學(xué)者希望能借助乳酸菌來有效減緩過敏反應(yīng)，并減少藥物的使用量［5-7］。因為許多乳酸菌在腸道中能通過平衡細胞和體液免疫應(yīng)答，使免疫系統(tǒng)處于健康穩(wěn)定狀態(tài)。本研究在前期試驗中亦發(fā)現(xiàn)活的乳桿菌具有抑制牛乳β-乳球蛋白過敏反應(yīng)的效果，但對滅活的乳酸菌是否具有與活菌相似的免疫學(xué)效應(yīng)尚不清楚。

基于乳酸菌與抑制食物過敏的發(fā)生、發(fā)展之間的緊密聯(lián)系，本研究構(gòu)建牛乳β-乳球蛋白過敏小鼠模型，分析熱致死的發(fā)酵乳桿菌對致敏小鼠Th1/Th2細胞動態(tài)平衡、CD4+/CD8+比值和過敏標(biāo)志性抗體表達的影響，為進一步確定乳酸菌抗牛乳過敏的作用與機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗菌株 發(fā)酵乳桿菌KLDS 1.0740由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室分離保存。

1.1.2實驗動物 雌性清潔級 BALB/c小鼠，6～8周齡，購自哈爾濱腫瘤醫(yī)院實驗動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境溫度 (23±2)℃，濕度50% ～75%，標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料喂養(yǎng)。

1.1.3主要試劑 乳清粉(新西蘭進口);BCA試劑盒 (中國 Beyotime 公司);IL-12、IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒(美國R＆D公司)、總IgE試劑盒(美國bethyl公司)、羊抗鼠 IgE酶標(biāo)二抗(英國 AbD Serotec公司)、羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗(中國中杉金橋公司)、RPMI1640培養(yǎng)液(美國 Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)、淋巴細胞分離液(Salarbio公司)、牛乳β-乳球蛋白標(biāo)品和弗氏完全佐劑(FCA，Sigma公司);FITC-抗小鼠CD3抗體、PE抗小鼠CD4抗體、PEcy5抗小鼠CD8抗體(eBioscience公司)等。

1.2方法

1.2.1菌株的活化與菌懸液的制備 發(fā)酵乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18小時后4 000 r/min、10分鐘離心收集菌體，用滅菌0.01 mol/L、pH7.4 PBS離心洗滌重懸，調(diào)整菌懸液濃度約為2×1010cfu/ml，經(jīng)100℃ 30分鐘熱處理后(檢驗證實無活菌存在，且仍保持正常細菌形態(tài))，冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2牛乳β-乳球蛋白的制備［8］以乳清粉為原料，采取高鹽低pH法分離純化β-乳球蛋白。透析除鹽后凍成干粉備用，SDS-PAGE電泳鑒定蛋白純度，BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)測定β-乳球蛋白濃度。

1.2.3動物模型建立［9］將BALB/c小鼠隨機分組(每組8只)，即空白組、致敏組和熱致死的發(fā)酵乳桿菌組。自第1天起，發(fā)酵乳桿菌組小鼠灌胃低、中、高劑量(0.2、1.0、5.0 μg)菌液 0.1 ml/(天·只)，共28天，空白組同時以等量生理鹽水灌胃。致敏組和發(fā)酵乳桿菌組小鼠在第7天、第21天、第28天給予腹腔注射0.2 ml 0.5 mg/ml過敏原(1 ml弗氏佐劑+1 ml 1 mg/ml BLG)，空白組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。于實驗的第30天，即末次腹腔注射48小時后檢測指標(biāo)。

1.2.4ELISA法檢測細胞因子［10］無菌取小鼠脾臟，用玻璃針芯在200目篩網(wǎng)上研磨后，加入到RPMI1640培養(yǎng)液中制成單細胞懸液。加入淋巴細胞分離液進行離心，分離出淋巴細胞，再用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌(4 000 r/min)2次。調(diào)細胞密度為2×106個/ml。將細胞與含有100 ml/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基及BLG(終濃度1 g/L)加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔總體積200 μl，每組設(shè)3個重復(fù)(n=3)。在37℃，50 ml/L CO2培養(yǎng)箱飽和濕度條件下培養(yǎng)48小時后，離心收集上清。嚴(yán)格按照各ELISA試劑盒說明書進行操作，在波長450 nm處用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度(A)值，從相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線查得各樣品的 IL-12、IFN-γ、IL-4濃度。

1.2.5ELISA法檢測抗體水平［11］摘除小鼠眼球放血，離心后吸取血清，嚴(yán)格按照各試劑盒說明書檢測小鼠血清中總IgE、BLG特異性IgE和總IgG濃度。

1.2.6流式細胞儀檢測T細胞亞群［12］無菌取小鼠脾臟組織研碎制成細胞懸液，將細胞濃度調(diào)至2×106個/ml，分別與 FITC 標(biāo)記的抗 CD3+、PE 標(biāo)記的抗CD4+、PEcy5標(biāo)記的抗CD8+單克隆抗體反應(yīng)(4℃，30分鐘)。PBS緩沖液清洗后，細胞懸浮于PBS緩沖液中，通過流式細胞儀檢測其表面抗原分子的表達情況。

1.3數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組定量檢測數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1發(fā)酵乳桿菌對致敏小鼠Th1/Th2細胞平衡的影響 由于Th1、Th2細胞的比例同 IFN-γ和 IL-4的分泌水平密切相關(guān)，故本實驗以IFN-γ/IL-4比值為代表研究乳酸菌對淋巴細胞Th1/Th2平衡的影響。如表1結(jié)果所示，與致敏組相比，不同劑量發(fā)酵乳桿菌組小鼠的IL-4質(zhì)量濃度顯著下降(P＜0.05)，而IFN-γ分泌值明顯增高(P＜0.05)。由于發(fā)酵乳桿菌中、高劑量組比發(fā)酵乳桿菌低劑量組更明顯地促進了IFN-γ的分泌(P＜0.05)，使其IFN-γ/IL-4比值顯著高于空白組和致敏組(P＜0.05)。

表1 發(fā)酵乳桿菌干預(yù)對BLG致敏小鼠Th1/Th2細胞平衡的影響(pg/ml，±s，n=3)Tab．1 Effect of L．fermentum on the Th1/Th2 cell balance in BLG-immunized mice(pg/ml，x— ± s，n=3)

表1 發(fā)酵乳桿菌干預(yù)對BLG致敏小鼠Th1/Th2細胞平衡的影響(pg/ml，±s，n=3)Tab．1 Effect of L．fermentum on the Th1/Th2 cell balance in BLG-immunized mice(pg/ml，x— ± s，n=3)

Note：One-way ANOVA，statistically significant difference：1)P＜0.05 vs allergy group;2)P＜0.05 vs blank group.

Groups IL-12(ng/ml) IFN-γ(ng/ml) IL-4(ng/ml) IFN-γ/IL-4 Blank group 4.74±0.11 623.08±23.39 80.34±3.35 7.77±0.58 Allergy group 4.18±0.10 344.87±29.87 103.19±4.36 3.34±0.26 Low level L．fermentum group 4.33±0.03 517.95±9.681)2) 73.35±3.041) 7.07±0.251)Middle level L．fermentum group 4.36±0.27 556.41±18.181)2) 53.45±5.261)2) 10.46±0.881)2)High level L．fermentum group 4.52±0.07 608.97±17.341) 44.98±5.591)2) 13.53±0.891)2)

表2 發(fā)酵乳桿菌干預(yù)對BLG致敏小鼠淋巴細胞亞群的影響Tab．2 Effect of L．fermentum on the lymphocyte subgroups in BLG-immunized mice

圖1 發(fā)酵乳桿菌干預(yù)對BLG致敏小鼠血清中總IgE(A)、BLG特異性IgE(B)和總IgG(C)抗體含量的影響Fig．1 Effect of L．fermentum on the serum levels of total IgE(A)，BLG-specific IgE(B)and total IgG(C)in BLG-immunized mice

2.2發(fā)酵乳桿菌對致敏小鼠抗體分泌的影響 如圖1結(jié)果所示，BLG能夠誘導(dǎo)小鼠總IgE、BLG特異性IgE和總IgG水平升高，且顯著高于空白組(P＜0.05)。與致敏組相比，不同劑量發(fā)酵乳桿菌組均可顯著降低致敏淋巴細胞上清液中各抗體的含量(P＜0.05)。而中、高劑量發(fā)酵乳桿菌組更有效地抑制了總 IgE、BLG特異性 IgE和總 IgG的分泌(P＜0.05)，且與空白組相比差異不顯著(P＞0.05)。

2.3發(fā)酵乳桿菌對致敏小鼠脾細胞T細胞亞群的影響 如表2結(jié)果所示，口服發(fā)酵乳桿菌后，致敏組小鼠皮細胞中CD3+、CD4+T細胞數(shù)降低，CD4+/CD8+比值減小，與空白組比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與致敏組比較，經(jīng)發(fā)酵乳桿菌干預(yù)后可明顯升高致敏小鼠的CD3+T細胞數(shù)和CD4+/CD8+比值(P＜0.05)，特別是口服高劑量發(fā)酵乳桿菌后的CD3+T細胞數(shù)和CD4+/CD8+比值與空白組相比無顯著性差異。

3 討論

研究者多認(rèn)為，Th2細胞占優(yōu)勢的Th1/Th2細胞失衡是牛乳過敏發(fā)病最重要的免疫學(xué)異常［2］，即Th2細胞作為介導(dǎo)體液免疫的重要細胞，其數(shù)量增加、功能亢進的最終結(jié)果是誘導(dǎo)B細胞產(chǎn)生高水平的IgE應(yīng)答和嗜酸性粒細胞活化，并引起組胺、白三烯等多種炎性介質(zhì)釋放，導(dǎo)致過敏反應(yīng)發(fā)生。

以往研究表明，乳桿菌細胞壁組分可以作為一種主要的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)［13］，例 如 未 甲 基 化 的CpG、肽聚糖(PG)和脂磷壁酸(LTA)等，它們被腸上皮細胞或樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)上的Toll樣受體家族(Toll-like receptor，TLRs)識別后，通過TIR區(qū)域向胞漿內(nèi)傳導(dǎo)信號，激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶［14］，釋放細胞因子、表達共刺激分子等，從而激活Th0細胞向不同的亞型細胞分化(如Th1、Th2細胞)，在天然免疫、炎癥反應(yīng)和獲得性免疫中發(fā)揮作用。另外，乳桿菌在熱致死過程中，菌體的細胞膜壁遭到破壞，也可能釋放出細胞內(nèi)與調(diào)節(jié)免疫活性相關(guān)的活性物質(zhì)(如菌體蛋白或多糖類物質(zhì)等)［15］。本研究中口服熱滅活的發(fā)酵乳桿菌菌液能誘導(dǎo)致敏小鼠淋巴細胞分泌IL-12和IFN-γ，降低IL-4水平，使得IFN-γ/IL-4比值顯著升高，促進了Th1型免疫應(yīng)答，并可能通過逆轉(zhuǎn)Th2細胞過度亢進來阻斷IgE的分泌。由此推測，乳桿菌的細胞壁成分、代謝產(chǎn)物、菌體細胞等均有可能刺激機體的腸道粘膜免疫系統(tǒng)，這可能是其抑制過敏發(fā)生的機理之一。

目前，IgG抗體在過敏反應(yīng)中的作用也日益受到重視，但一直存在爭議。Durham 等認(rèn)為［16］，IgG抗體與IgE抗體競爭結(jié)合抗原，進而抑制肥大細胞和嗜堿性粒細胞激活，從而抑制過敏。Little［17］認(rèn)為，IgG參與過敏反應(yīng)。資料表明，蝦、花生過敏患者體內(nèi)IgG水平比正常人顯著升高。本實驗中4種不同的乳桿菌與空白對照組比較，均可下調(diào)總IgG分泌量，該結(jié)果提示乳桿菌可能通過下調(diào)總IgG的生成量或抑制其合成來緩解過敏反應(yīng)，但其具體的作用機制還不是很清楚，有待進一步研究。

CD4+、CD8+T細胞對機體的細胞免疫和體液免疫有重要的調(diào)節(jié)作用。CD4+和CD8+T總量的提高固然重要，但CD4+/CD8+比值保持動態(tài)平衡(正常情況下約為2∶1)對穩(wěn)定機體免疫功能是必需的，在免疫缺陷性疾病時此比值會出現(xiàn)倒置現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，過敏組小鼠T細胞亞群改變明顯，CD3+T顯著低于空白組，CD4+/CD8+比值降低，與文獻［18］報道相一致，而發(fā)酵乳桿菌干預(yù)可提高過敏小鼠脾淋巴細胞中CD3+和CD4+T細胞的比例，優(yōu)化CD4+/CD8+比值。因此，我們認(rèn)為通過飼喂發(fā)酵乳桿菌能使失調(diào)的T細胞亞群恢復(fù)平衡，這也可能是其緩解過敏的機制之一。

1 Carlo C，F(xiàn)rancesco B，Barbara B et al.Cow＇s milk protein allergy in children：a practical guide［J］.Italian J Pediatrics，2010;36(5)：1816-1824.

2 Pasquale M，Giuseppe M，Maria L P.Food allergy in gastroenterologic diseases：Review of literature［J］.World J Gastroenterol，2006;12(48)：7744-7752.

3 王小卉，楊 毅，王 瑩et al.嬰兒腸道菌群的形成及其與食物過敏的關(guān)系［J］.實用兒科臨床雜志，2004;19(9)：756-758.

4 Romagnani S.The increased prevalence of allergy and the hygiene hypothesis：missing immune deviation，reduced immune suppression，or both? ［J］.Immunology，2004;112(3)：352-363.

5 Flinterman A E，Knol E F，van Ieperen-van Dijk A G et al.Probiotics have a different immunomodulatory potential in vitro versus ex vivo upon oral administration in children with food allergy［J］.Allergy Immunol，2007;143(3)：237-244.

6 Akiko T，Shinpei T，Shigeru F et al.Lactobacillus Acidophilus strain l-92 regulates the production of Th1 cytokine as well as Th2［J］.Cytokines，2007;56(3)：293-301.

7 Yumi I，Noriyuki I，Xiao J Z.Suppressive effects of Bifidobacterium breve strain M-16V on T-helper type 2 immune responses in a murine model［J］.Biol Pharm Bull，2009;32(4) ：760-763.

8 王子龍，林召豐，黃 霞 et al.兩種分離β-乳球蛋白方法的比較［J］.食品工業(yè)科技，2008;29(12)：153-154.

9 Segawa S，Nakakita Y，Takata Y et al.Effect of oral administration of heat-killed Lactobacillus brevis SBC8803 on total and ovalbumin-specific immunoglobulin E production through the improvement of Th1/Th2 balance［J］.International J Food Microbiology，2008;121(1)：1-10.

10 Fujiwara D，Inoue S，Wakabayashi H et al.The anti-allergic effects of lactic acid bacteria are strain dependent and mediated by effects on both Th1/Th2 cytokine expression and balance［J］.International Archives of Allergy and Immunology，2004;135(3)：205-215.

11 Karine A P，Christophe C，Herve B et al.Evaluation of a high IgE-responder mouse model of allergy to bovine b-lactoglobulin BLG：development of sandwich immunoassays for total and allergen-specific IgE，IgG1and IgG2a in BLG-sensitized mice［J］.J Immunol Methods，2000;235(2)：21-32.

12 陳瑩瑛，李 俊，施 磊et al.玉屏風(fēng)多糖對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠T細胞亞群的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2010;26(5)：588-592.

13 余葉紅，郭本恒，吳正鈞et al.干酪乳桿菌LC2W細胞壁組分對RAW264.7巨噬細胞吞噬活性的影響［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2009;21(1)：23-29.

14 Guei-Cheng P，Ching-Hsiang H.The efficacy and safety of heat-killed Lactobacillus paracasei for treatment of perennial allergic rhinitis induced by house-dust mite［J］.Pediatric Allergy and Immunology，2005;16(5)：5433-5438.

15 Segawa S，Hayashi A，Nakakta Y et al.Oral Administration of heatkilled Lactobacillus brevis SBC8803 ameliorates the development of dermatitis and inhibits immunoglobulin E production in atopic dermatitis model NC/Nga mice［J］.Pharmaceutical Society of Japan，2008;31(5)：884-889.

16 Durhma T.Immunologic changes associated with allergen immunotherapy［J］.J Allergy and Clinical Immunology，1998;102(2)：157-

164.

17 Little C H，Geogriou G M，Miehael J et al.Production of serum immunoglubulins and T cell antigen binding molecules specific for cow＇milk antigen in adults intolerant to cow＇milk［J］.Immunology and Immunopathology，1998;89(2)：160-170.

18 連廣琬，趙明奇，李翊泉et al.流式細胞術(shù)檢測過敏性紫癜患兒外周血調(diào)節(jié)性T細胞的研究［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2010;10(1)：27-30.