內皮特異性分子1在腫瘤治療中的研究進展

范旻浩， 李婷， 張群嶺，胡夕春

內皮特異性分子1(endothelial specific molecule-1，ESM-1)，也稱為endocan，作為一種由內皮細胞分泌的可溶性產物，最初是由Lassalle等人于1996年在人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的 cDNA文庫克隆時意外發(fā)現(xiàn)的，同時發(fā)現(xiàn)其在肺組織和腎組織來源的血管內皮細胞中表達。近年來研究顯示，ESM-1可能通過多種信號傳導途徑參與體內的炎癥反應、血管生成以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等病理生理過程，并在腫瘤預后、抗血管藥物療效預測等方面具有潛在的應用價值。

1 ESM-1的基因結構

ESM-1由人類5號染色體5q11.2上的單一基因編碼，含有3個外顯子和2個內含子。1號外顯子長362bp，2號長150bp，3號長1560bp。其中1號和部分2號外顯子編碼一個含有110個氨基酸，并且富含半胱氨酸的氨基末端。2號外顯子同時編碼一個富含F(xiàn)(113FPFFQY118)的特殊區(qū)域，該區(qū)域被認為與ESM-1的功能密切相關。最大的3號外顯子編碼ESM-1蛋白羧基端33個氨基酸區(qū)域，該區(qū)域含有提前終止密碼子和137位絲氨酸上的O-糖基化位點。

2 ESM-1的基因產物與表達調控

2.1 ESM-1的分子結構 ESM-1是一種分子量50 kDa的由內皮細胞分泌的可溶性硫酸皮膚素蛋白多糖(dermatan sulphate proteoglycan，DSPG)。完整的ESM-1分子包含165個氨基酸的核心蛋白以及以共價鍵的形式連接在第137位絲氨酸殘基上的一條黏多糖單鏈，即硫酸皮膚素鏈。硫酸皮膚素是由N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(iduronate，IdoA)二糖重復單位構成的線性多糖。其中艾杜糖醛酸成分是ESM-1的重要功能結構。現(xiàn)已有的多項研究在健康志愿者、膿毒癥患者及腫瘤患者的血清和組織標本中檢測到以蛋白多糖形式存在的ESM-1［1-4］。對于研究者來說，以HUVEC為代表的血管內皮細胞模型ESM-1的表達量很低，往往不能滿足科研需要，Sarrazin等［3］通過基因重組建立的人體腎臟胚芽細胞模型(HEK293)，能夠長周期高水平表達具備DS活性鏈的ESM-1蛋白聚糖分子，其ESM-1產量超過傳統(tǒng)細胞模型60倍(174.3 ± 49.7 μg/mL vs.2.9 ±1.1 μg/mL)，這一成果為深入研究ESM-1以及其他新近發(fā)現(xiàn)的糖基化細胞因子提供了條件。

2.2 ESM-1的選擇性表達 基因在轉錄過程中的選擇性剪切使編碼ESM-1的基因能產生兩種截然不同的表達產物:一種是成熟的ESM-1分子，包含完整的核心蛋白、F113和F116位的苯丙氨酸富集區(qū)以及硫酸皮膚素黏多糖單鏈。ESM-1的促癌作用主要與黏多糖單鏈和苯丙氨酸富集區(qū)相關;另一種產物較正常的ESM-1分子缺少了2號外顯子區(qū)域，稱之為 endocanΔ2。Depontieu 等［5］的 研 究顯 示endocanΔ2不具備促腫瘤生長的作用，具體表現(xiàn)在:與ESM-1相比，endocanΔ2多肽鏈與硫酸皮膚素黏多糖單鏈(DS鏈)的結合率下降(47.4%;95%CI:42.9% ～50.2%)，其作用下的裸鼠移植瘤體積更小(0.04 cm3vs.1 cm3)，在非小細胞肺癌組織中未能檢測到其含量的升高。這項研究明確ESM-1基因2號外顯子所編碼的苯丙氨酸富集區(qū)以及含艾杜糖醛酸的硫酸皮膚素鏈是ESM-1的主要功能區(qū)域?；虻倪x擇性剪切也許是ESM-1功能調節(jié)機制的一部分。

2.3 ESM-1的表達調控 ESM-1表達水平受一系列炎癥介質、細胞因子調控。許多炎性介質，如腫瘤壞死因子α、白細胞介素1等均能促使ESM-1高表達。Sarrazin等［6］的研究顯示，ESM-1基因表達水平可受革蘭氏陰性細菌細胞壁上的脂多糖(LPS)上調。在體外試驗中，加入腫瘤壞死因子α、白細胞介素1和(或)細菌脂多糖后，內皮細胞分泌ESM-1的水平上升，這種上升可持續(xù)72 h以上［7］。嚴重膿毒癥患者血清ESM-1水平尤其高，提示血清ESM-1表達水平和炎性因子釋放相關［8］。研究發(fā)現(xiàn)ESM-1表達水平和某些血管生成因子，如血管內皮生長因子VEGF-A、成纖維生長因子FGF-2之間有較強的相關性。Aitkenhead等［9］利用 cDNA探針和Northern blot發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的血管內皮細胞在VEGF和FGF-2刺激下ESM-1基因表達水平上升了4倍。其可能的機制是，ESM-1的DS鏈與FGF-2結合并且促進FGF-2依賴的血管內皮細胞增殖，從而導致新生血管形成。而 VEGF-A通過3-磷酸肌醇激酶(phospho inositide 3-kinase，PI3K)-Akt信號通路上調ESM-1的表達［10］。目前發(fā)現(xiàn)其他對ESM-1有肯定上調作用的因子還包括蛋白激酶C激活劑、維甲酸、核因子κB、VEGF-C等。

3 ESM-1的作用機制

3.1 激活肝細胞生長因子/離散因子轉導通路 肝細胞生長因子/離散因子(hepatocyte growth factor/scatter factor，HGF/SF)是一種間葉細胞和基質細胞來源的生長調節(jié)因子，能促進內皮和上皮細胞的生長發(fā)育及分化，被認為與胚胎時期器官的形成有關，異常表達時則促進腫瘤細胞的增殖和轉移［11］。IdoA在ESM-1和HGF/SF的特異性聯(lián)系過程中扮演了重要角色。IdoA與HGF/SF結構中的O-硫酸己糖胺結合，這種結合對HGF酪氨酸受體C-met的活化及其介導的細胞信號通路極其重要，C-met作為HGF的唯一受體蛋白，由原癌基因C-met編碼，被激活后導致ras/致分裂素激活蛋白激酶、PI3K/蛋白激酶B等信號轉導途徑的級聯(lián)激活，使細胞發(fā)生一系列的生物學效應，如分散、侵襲、細胞運動、細胞遷移，最終與腫瘤發(fā)生、腫瘤血管生成及腫瘤轉移相關。

3.2 抑制腫瘤免疫監(jiān)控 正常機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞具有監(jiān)控和殺滅作用，這一作用通常由T細胞發(fā)揮細胞毒作用完成，而T細胞和腫瘤細胞的接觸往往需要通過血管內皮屏障。ESM-1抑制淋巴細胞和單核細胞表達的細胞粘附分子1(ICAM-1)和淋巴細胞功能相關性抗原1(LFA-1)間的相互作用，ESM-1 DS鏈上的硫酸根結合位點與LFA-1相互作用，改變后者構型，干擾LFA-1與ICAM-1的結合，從而抑制LFA-1介導的淋巴細胞功能。譬如淋巴細胞對內皮的粘附以及跨內皮細胞遷徙，干擾淋巴細胞的歸巢和聚集，阻斷T細胞和腫瘤細胞的接觸通路。這一機制同樣影響了自然殺傷細胞對腫瘤的結合殺傷，De Freitas等［12］研究發(fā)現(xiàn) ESM-1劑量相關地對NK細胞在內皮中遷徙起抑制作用。

3.3 促進腫瘤血管和淋巴管生成 成纖維生長因子FGF-2和血管內皮生長因子VEGF是血管內皮增殖、萌芽、成型過程中的特異性刺激因子。如前所述，ESM-1的DS鏈能與FGF-2結合并促進FGF-2依賴的血管內皮細胞增殖，VEGF-A則通過PI3KAkt信號通路調節(jié)ESM-1的表達。體外研究顯示，ESM-1能促進血管內皮細胞有絲分裂，Gerritsen等［13］發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)中的血管內皮細胞中，F(xiàn)GF-2、VEGF-A/C、HGF等與ESM-1呈正反饋式地相互促進表達，與此同時血管內皮細胞增生更為明顯，且更易形成管狀結構。然而，單獨加入ESM-1則對內皮細胞功能無影響［14］。另外，ESM-1對淋巴管形成也有促進作用，Shin等［15］分別用細胞培養(yǎng)和小鼠體內試驗的方式證明ESM-1和VEGF-A、VEGF-C可相互促進，共同引起淋巴管內皮細胞的增殖和遷徙，而單獨存在ESM-1或VEGF-A/C時則無類似效果。這同樣驗證了ESM-1促血管淋巴管生成作用需要間接通過FGF-2、VEGF來實現(xiàn)。

4 ESM-1的應用價值

4.1 腫瘤血管生成標志 腫瘤的生長有賴于血供營養(yǎng)，血管生成在富血管腫瘤，如腎細胞癌、肺癌、成神經膠質細胞瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用［16-17］。腫瘤血管內皮細胞的生物學行為不同于正常血管內皮，往往是雜亂的、連接松散的、出芽分枝豐富的、錯亂的蜂窩狀血管墻。找到一種能夠特異性反映腫瘤血管內皮細胞活性的生物標志物，尤其是當針對腫瘤細胞本身的標志物缺乏或應用抗血管靶向藥物時，就顯得十分必要。

目前已存在多種對血管生成具有預測作用的生物標志物，包括組織學和血清學指標，如微血管密度(microvessel density，MVD)、血管內皮生長因子、可溶性血管內皮生長因子受體(sVEGFR)等。但這些標志物無法全面并特異地反映腫瘤新生血管情況，且取材困難。而ESM-1在各種體外培養(yǎng)增殖中的血管內皮細胞，包括冠狀動脈、肺動脈、毛細血管來源的內皮中都有高表達，而在富含血管的大腦、肝臟、心臟等器官標本中卻無表達上調［9］，提示ESM-1并不在休眠期的血管內皮細胞中表達，因而可以特異性反映內皮細胞增殖活性。Almog等［18］在一項包含乳腺癌、成膠質細胞瘤、骨肉瘤和脂肪肉瘤的裸鼠移植瘤模型研究中驗證了潛伏期腫瘤向高增殖富血管腫瘤轉化和ESM-1基因表達水平的高度相關性，在所有測試的髙增殖富血管腫瘤系中ESM-1水平均顯著上升，特別在成膠質細胞瘤和脂肪肉瘤中，ESM-1基因表達水平增加了30倍。Depontieu等［5］和Recchia等［19］用腎胚芽細胞293和視網(wǎng)膜血管所做的動物模型也分別顯示ESM-1的上升能促進腫瘤生長和血管生成。

通過基因原位雜交、免疫組化等方法，研究者們陸續(xù)在多種組織器官來源的腫瘤中發(fā)現(xiàn)ESM-1基因及其產物過表達現(xiàn)象。Grigoriu等［7］用逆轉錄PCR的方法分析24例非小細胞肺癌患者的手術標本，發(fā)現(xiàn)相對周邊正常組織，腫瘤組織ESM-1-mRNA上升了2.5 倍(P=0.029)。Leroy 等［4］通過免疫組化分析44例腎透明細胞癌患者腫瘤標本，其中40例出現(xiàn)ESM-1高表達，主要表達部位在血管內皮細胞胞漿內，同時該研究還發(fā)現(xiàn)其中14例患者血清ESM-1水平較正常對照上升了3～10倍。Buckanovich等［20］也使用基因探針分析卵巢癌腫瘤血管相關因子時證實ESM-1基因相對正常組織高表達。而免疫學查找胞漿ESM-1的方法則證實肺、腦、肝、腎來源的腫瘤血管內皮細胞胞漿ESM-1水平升高［10，14，21-22］。然而，Zuo 等［23］的研究發(fā)現(xiàn)，在結腸腺癌組織中ESM-1的表達反而下降，mRNA及其產物的表達率分別是36.1%和33.3%，而正常對照組織中相應數(shù)值是70.4%和92.6%。同時他們還發(fā)現(xiàn)ESM-1表達水平與年齡、性別、臨床分期、腫瘤大小及淋巴結轉移情況都無關，但和腫瘤的分化程度正相關，即分化越好，ESM-1水平越高。同樣的情況在胃腺癌中也有出現(xiàn)，Zhang等［24］發(fā)現(xiàn)胃腺癌組織較正常組織ESM-1表達下降(30.1%vs.58.5%，P＜0.05)，且與分化程度正相關。消化道腫瘤這一有別于大多數(shù)情況的研究結論如能被反復證實，也許有助于深入揭示ESM-1在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所扮演的角色。

鑒于血管生成是腫瘤增殖進展的因素之一，ESM-1作為血管生成相關因子，自然被看做是潛在的預后指標。van't Veer等［25］在使用基因芯片分析78例乳腺癌患者預后相關基因時發(fā)現(xiàn)，預后好(5年內無遠處轉移)的35例患者ESM-1基因高表達的比例為5/35，預后差的43例患者這一數(shù)值則為18/43，這一研究共包含70項被認為與乳腺癌預后可能相關的基因。Grigoriu等［7］對30例非小細胞肺癌(NSCLC)患者的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，總生存期(overall survival，OS)與血清 ESM-1 水平(P=0.013)、腫塊大小(P=0.011)、淋巴結分期(P=0.03)、遠處轉移情況(P=0.002)有關，而與性別、年齡、組織學類型(鱗癌、腺癌等)無關。血清ESM-1水平低于和高于1.3 ng/mL的兩組患者中位總生存期有明顯差異(6個月vs.3個月)。但COX分析顯示只有當遠處轉移情況不納入考慮時ESM-1才是OS的預測因子，因此認為ESM-1升高并非是NSCLC獨立預后因子，TNM分期依舊是NSCLC最主要的生存預后因子。Huang等［22］對90例肝細胞癌(HCC)患者的研究中，將ESM-1標記的微血管密度(ESM1-MVD)作為觀察指標，發(fā)現(xiàn)低ESM1-MVD組1、2、3年生存率比高 endocan-MVD 組都高(77.0%，42.7%，33.7%vs.47.6%，12.8%，0%;P ＜0.01)。同時多變量分析還顯示ESM1-MVD是HCC患者總生存的獨立預后因素(HR=3.31)。

4.2 抗腫瘤血管生成靶向治療預測因子 如前所述，ESM-1的表達隨VEGF的上調而上調，因而可以作為一種潛在的反映抗VEGF-VEGFR通路藥物活性的檢測指標。Grigoriu等［7］在體外培養(yǎng)的內皮細胞上所做的研究顯示，加入抗VEGF抗體后，可劑量依賴性地抑制VEGF介導的ESM-1表達水平，當抗體劑量達到0.1 μg/mL時ESM-1表達幾乎被完全抑制(95%)。而抗 VEGF受體類藥物也可下調ESM-1。Hardwick等［26］通過基因芯片的方法發(fā)現(xiàn)，接受VEGF受體2酪氨酸激酶抑制劑處理后ESM-1基因被顯著抑制。Leroy等［4］在體外培養(yǎng)的 VEGF誘導下的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中加入舒尼替尼后，ESM-1的表達水平下降(IC50=5 ng/mL)。體內方面，ESM-1作為藥物療效預測指標的臨床研究尚不多見，值得一提的是Hatfield等［27］于2011年在對40例急性髓性白血病(AML)的研究中將ESM-1做為主要觀察指標，發(fā)現(xiàn):(1)AML患者血清ESM-1水平相比對照組有明顯升高，平均為0.7 ng/mL，最高6.8 ng/mL，而對照組(21名健康志愿者)最高為0.2 ng/mL;(2)經過阿糖胞苷強化治療后患者血清ESM-1水平顯著下降(Wilcoxon’s test，P=0.0004);(3)合并感染的患者血清ESM-1水平上升(P=0.003);(4)ESM-1并非腫瘤細胞本身所分泌，因為體外培養(yǎng)的AML細胞并無ESM-1表達，且治療期間ESM-1水平變化與骨髓AML細胞增殖情況無關。實體瘤方面，Zhang等［24］用 RT-PCR和Western blot的方法分析經褪黑素處理的胃腺癌細胞，發(fā)現(xiàn)ESM-1表達上調，但這一研究仍然停留在體外水平。

由上可見，體外內皮細胞ESM-1的釋放可被抗VEGF/VEGFR藥物所調節(jié)，同時，血清ESM-1水平與性別、年齡、遺傳特征、細胞形態(tài)等個體差異無關。故ESM-1也許可以作為反映腫瘤對抗VEGF/VEGFR類藥物療效的標志物。但其血清水平受機體感染、骨髓激活等諸多臨床常見混雜因素影響，作為預測因子時須注意排除此類因素的干擾。

5 結語

ESM-1通過抑制激活HGF介導的原癌基因轉導通路，腫瘤免疫監(jiān)控，與VEGF、FGF-2等協(xié)同促進腫瘤血管和淋巴管增生，起到促進腫瘤生長的作用。現(xiàn)有的反應血管增生的指標，如MVD、VEGF等，無法全面并特異地反映腫瘤新生血管情況。ESM-1不在休眠期的血管內皮細胞中表達，因而可以反映內皮細胞增殖活性，對于富血管腫瘤的生長情況具有預測價值。同時ESM-1的表達水平與VEGF的相關性，提示其可以作為一種潛在的反映抗VEGFVEGFR通路藥物活性的檢測指標，未來應充實其臨床應用方面的研究。鑒于ESM-1能夠通過多種途徑促進腫瘤生長，開發(fā)相應的靶向治療藥物也許能提供腫瘤治療的新手段。

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