膀胱癌組織中VEGF和Clusterin的表達(dá)及其相關(guān)性分析

崔熙軍，李文通

膀胱癌(bladder cancer)是泌尿外科常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)占全身腫瘤的第8位，在我國，膀胱癌為發(fā)病率最高的10種腫瘤之一［1］。膀胱癌中90%以上為尿路上皮癌，膀胱尿路上皮癌的病因尚不清楚，近年來發(fā)現(xiàn)血管生成和凋亡相關(guān)因子在膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要的作用。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促進(jìn)腫瘤血管生成的主要因素之一［2］，對(duì)腫瘤血管形成及腫瘤生物學(xué)行為均有重要的影響。Clusterin是從山羊睪丸網(wǎng)分泌液中分離出來的一種蛋白質(zhì)，Clusterin通過抗凋亡參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3］。我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)65例膀胱癌組織和20例正常黏膜組織進(jìn)行VEGF和Clusterin的檢測(cè)，旨在探討其在膀胱癌中的表達(dá)意義及其相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 挑選2007年7月至2011年6月間寧津縣人民醫(yī)院膀胱癌標(biāo)本65例入組。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋;按WHO(2004)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):低級(jí)別36例，高級(jí)別29例;臨床分期按UICC標(biāo)準(zhǔn):淺表性膀胱腫瘤Tis～T145例，浸潤性腫瘤T2～T420例;單發(fā)49例，多發(fā)16例;所有患者術(shù)前均未行化療或放療。另以20例非腫瘤患者正常膀胱黏膜組織石蠟標(biāo)本為對(duì)照組。

1.2 主要試劑 VEGF鼠源單克隆一抗購自邁新試劑公司，兔抗Clusterin多克隆抗體、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司，SP試劑盒購自武漢博士德生物制品有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 所有標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色進(jìn)行病理觀察。按試劑盒步驟進(jìn)行免疫組化操作，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知VEGF和Clusterin陽性切片作為陽性對(duì)照。

1.4 陽性結(jié)果的判定 光鏡下細(xì)胞膜、細(xì)胞漿中有淡黃至棕黃顆粒出現(xiàn)，為VEGF陽性反應(yīng)細(xì)胞。光鏡下胞漿染為淡黃至棕黃，為Clusterin陽性細(xì)胞表達(dá)。綜合考慮切片中陽性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞數(shù)的百分比和陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度兩項(xiàng)指標(biāo)，半定量判定結(jié)果。VEGF和Clusterin陽性細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)相同，根據(jù)細(xì)胞染色程度進(jìn)行四級(jí)評(píng)分:無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。每例隨機(jī)選取不重復(fù)5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野中陽性細(xì)胞所占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比，根據(jù)切片中陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行五級(jí)評(píng)分:陰性0分，0＜陽性細(xì)胞＜10%為1分，10%≤陽性細(xì)胞＜50%為2分，50%≤陽性細(xì)胞＜75%為3分，陽性細(xì)胞≥75%為4分。采用二次計(jì)分法，將染色程度得分與陽性細(xì)胞百分比得分相乘，0≤乘積 ＜3為“－”，3≤乘積 ＜6為弱陽性(+)，6≤乘積＜9為中陽性(++)，乘積≥9為強(qiáng)陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)關(guān)系的分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF、Clusterin在膀胱癌中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示VEGF在膀胱癌組以中、強(qiáng)陽性表達(dá)為主，而在對(duì)照組以陰性表達(dá)為主，或僅表達(dá)為弱陽性(表1)。膀胱癌組中VEGF陽性表達(dá)率較對(duì)照組高(P＜0.05)(表2)。同樣，Clusterin在膀胱癌組也以中、強(qiáng)陽性表達(dá)為主，對(duì)照組中鮮有表達(dá)，或僅表達(dá)為弱陽性(表1)，且膀胱癌組中Clusterin陽性率較對(duì)照組高 (P＜0.05)(表2)。

表1 VEGF和Clusterin在膀胱癌和正常組織中的表達(dá)強(qiáng)度

表2 VEGF和Clusterin在膀胱癌和正常組織中的表達(dá)

2.2 VEGF、Clusterin的表達(dá)與病理分級(jí)及臨床分期的關(guān)系 VEGF、Clusterin的陽性表達(dá)率均隨病理分級(jí)的升高而升高，高級(jí)別組的陽性表達(dá)率高于低級(jí)別組 (P＜0.05)，浸潤性腫瘤組(T2～T4)的陽性表達(dá)率高于淺表性腫瘤組(Tis～T1)(P＜0.05)，見表3。

2.3 VEGF和Clusterin在膀胱癌中表達(dá)的關(guān)系65例膀胱癌組織中，連續(xù)切片對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，在VEGF表達(dá)較高的區(qū)域，Clusterin表達(dá)亦較強(qiáng)。根據(jù)每例癌組織標(biāo)本VEGF和Clusterin的免疫組化計(jì)分行Spearman等級(jí)相關(guān)分析，r=0.637，提示VEGF和Clusterin在膀胱癌中的表達(dá)呈正性相關(guān)，見表4。

表3 VEGF和Clusterin的表達(dá)與膀胱癌病理分級(jí)和臨床分期的關(guān)系

表4 VEGF與Clusterin表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

1983年Senger首先發(fā)現(xiàn)了VEGF，后來在1998年Farrara從牛垂體濾泡星性細(xì)胞培養(yǎng)液中將其分離純化。VEGF在正常成人與動(dòng)物組織中水平較低，在腫瘤中，多數(shù)腫瘤細(xì)胞、腫瘤浸潤的巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞能分泌高水平VEGF［4］。VEGF可以為腫瘤細(xì)胞的生長和新生血管形成提供營養(yǎng)［5］，是血管生成不可缺少的促進(jìn)因子，從而為腫瘤的生長、浸潤、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。VEGF與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的關(guān)系在小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤組織中都得到了證實(shí)。

本試驗(yàn)利用免疫組化檢測(cè)VEGF在膀胱癌組織中的表達(dá)，并探討其與患者臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VEGF在膀胱癌組織中表達(dá)升高，而且與膀胱癌的病理分級(jí)、臨床分期有關(guān)，高級(jí)別組明顯高于低級(jí)別組，浸潤性膀胱癌高于淺表性膀胱癌。說明VEGF可能不僅促進(jìn)膀胱腫瘤血管形成［6］，使腫瘤生長和浸潤，而且隨著病程的進(jìn)展，VEGF表達(dá)逐漸增強(qiáng)，以T4期最顯著，與腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等生物學(xué)行為關(guān)系密切。

Clusterin是一種普遍存在于人體組織細(xì)胞中的異源二聚體硫酸化糖蛋白。Clusterin功能主要有參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、輔助生殖、抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞免疫等。有研究認(rèn)為由于Clusterin對(duì)mRNA選擇性剪接翻譯，形成分泌型 Clusterin(sClu)和核型 Clusterin(nClu)2種亞型，許多學(xué)者認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的存活可能與sClu的過表達(dá)和nClu的缺失有關(guān)。而Trougakso等［7］推測(cè)，Clusterin可能通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用而影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Clusterin在膀胱癌組織中表達(dá)升高，而且與膀胱癌的病理分級(jí)、臨床分期有關(guān)，高級(jí)別組明顯高于低級(jí)別組，浸潤性膀胱癌高于淺表性膀胱癌。此結(jié)果與Miyake等［8］在mRNA水平的研究結(jié)果相似，提示Clusterin可能在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，并可能與腫瘤的惡性臨床表型相關(guān)。

我們根據(jù)每例癌組織標(biāo)本VEGF和Clusterin免疫組化計(jì)分編秩進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，結(jié)果VEGF和Clusterin在膀胱癌中的表達(dá)顯著相關(guān)，提示在腫瘤形成過程中VEGF和Clusterin存在正性相關(guān)作用。這說明在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中，VEGF的促進(jìn)血管形成機(jī)制與Clusterin的凋亡抑制機(jī)制可能具有協(xié)同作用。

綜上所述，VEGF和Clusterin可能與膀胱癌的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為關(guān)系密切，采用免疫組化方法檢測(cè)二者的表達(dá)有助于對(duì)患者的預(yù)后評(píng)價(jià)。

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