AFP在原發(fā)性肝癌組織和血清中的表達與臨床、病理的相關(guān)性研究

劉勝榮， 刁 平，黃曉紅

AFP在肝癌患者血清中的陽性率為70%～80%。原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)血清中的AFP水平高低與肝細胞癌分化程度有關(guān)，并且其分布曲線呈兩頭低中間高。AFP的檢測不僅有助于原發(fā)性肝癌的診斷，而且可以作為原發(fā)性肝癌的療效考核標準，但并不能準確判斷預(yù)后。原發(fā)性肝癌病理切片中的AFP表達與其血清AFP值之間是否存在聯(lián)系尚不明確，AFP在病理組織中的表達強弱與預(yù)后的關(guān)系也未見報道。本課題通過對AFP在肝癌組織中的表達與血清AFP值關(guān)系以及與病理特點、預(yù)后的相關(guān)性進行研究，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測108例原發(fā)性肝細胞癌組織、76例癌旁組織、10例正常肝組織AFP表達情況，結(jié)合有術(shù)前血清AFP檢測值的61例患者進行比較研究，以探討AFP與原發(fā)性肝癌生物學(xué)行為的關(guān)系及組織和血清AFP表達的相關(guān)性對原發(fā)性肝細胞癌預(yù)后的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料 肝癌組織108例為2000年1月至2004年12月萊陽衛(wèi)校醫(yī)院、萊陽中心醫(yī)院進行肝癌切除術(shù)的標本，其中萊陽衛(wèi)校醫(yī)院31例，萊陽中心醫(yī)院77例;男87例，女21例;年齡32～70歲，平均年齡54.56歲。所選病例均經(jīng)病理證實為原發(fā)性肝癌，且術(shù)前均未行全身或局部化療。癌旁肝硬化組織選自76例肝癌旁存在肝硬化的標本，另選擇10例同期因膽道手術(shù)切除的部分正常肝組織為正常對照組織。所有病例均有完整隨訪資料，隨訪手術(shù)后存活時間，死亡時間為最后隨訪日期，即為終點。一直存活的患者，腫瘤未復(fù)發(fā)者存活時間增加12個月，復(fù)發(fā)患者存活時間增加6個月計算。

1.2 方法 采用免疫組化S-P法，AFP單克隆抗體、S-P免疫組化試劑盒購自福州邁新公司。將濃縮型AFP單克隆抗體按1∶200最佳稀釋度稀釋。染色步驟:常規(guī)石蠟切片脫蠟逐級乙醇入水;PBS沖洗5 min×3次;擦干切片周圍多余液體;3%過氧化氫甲醛溶液處理，室溫下于濕盒內(nèi)作用20 min;PBS沖洗5 min×3次;滴加適當稀釋的動物非免疫血清，室溫下于濕盒內(nèi)作用20 min，作用完畢后傾去多余血清液體，不沖洗;滴加AFP單克隆抗體，室溫下濕盒內(nèi)作用60 min;PBS沖洗5 min×3次;滴加生物素標記二抗，室溫下于濕盒內(nèi)作用20 min;PBS沖洗5 min×3次;滴加SP復(fù)合物，室溫下于濕盒內(nèi)20 min;PBS沖洗5 min×3次;滴加新配制的DAB顯色劑，室溫下5 min，鏡下觀察出現(xiàn)陽性結(jié)果且背景清晰時即可終止染色;自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。同時用PBS代替一抗作染色的陰性對照，用已知的陽性染色切片作陽性對照。

1.3 結(jié)果判斷 光鏡下胞漿染為淡黃至棕黃，為AFP陽性細胞表達。綜合考慮切片中陽性細胞占所觀察同類細胞數(shù)的百分比和陽性細胞染色強度兩項指標，半定量判定結(jié)果。根據(jù)細胞染色程度進行4級評分:無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。每例隨機選取不重復(fù)5個視野，計算每個視野中陽性細胞所占計數(shù)細胞百分比，根據(jù)切片中陽性細胞百分比進行5級評分:陰性0分，0＜陽性細胞＜25%為1分，25%≤陽性細胞＜50%為2分，50%≤陽性細胞＜75%為3分，陽性細胞≥75%為4分。采用二次計分法，將染色程度得分與陽性細胞百分比得分相乘，0≤乘積＜3為陰性(－)，3≤乘積＜6為弱陽性(+)，6≤乘積＜9為中陽性(++)，乘積≥9為強陽性(+++)，陰性和弱陽性為低表達，中陽性為中表達，強陽性為高表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。定量資料根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布與否，采用描繪，并行t檢驗(正態(tài)分布)。定性資料采用率或構(gòu)成比描繪，并行χ2檢驗或Fisher精確檢驗。3組生存時間采用Newman-Keuls檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中AFP的表達情況 AFP定位于細胞質(zhì)內(nèi)，陽性細胞的胞質(zhì)染色為淡黃色至棕褐色。

2.2 AFP在HCC不同病理分級中的表達 根據(jù)Ednondson分級，HCCⅠ級50例中，AFP表達76%(38/50);Ⅱ級34例中，AFP表達76.5%(26/34);Ⅲ/Ⅳ級24例中，AFP表達8.3%(2/24)。中分化腫瘤組織AFP表達最強，高分化稍低，低分化腫瘤組織中AFP的表達最低。三者之間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見表1。

表1 HCC組織AFP的表達強度與腫瘤病理分級的關(guān)系

2.3 癌組織、癌旁組織與正常肝組織中AFP表達的比較 癌組織中AFP的表達占61.1%(66/108)，癌旁組織表達占100%(76/76)，正常肝組織表達(0/10)，三者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 AFP表達強度與患者預(yù)后 108例肝癌組織中AFP的表達強度及對應(yīng)預(yù)后平均生存時間見表2，顯示AFP低表達者術(shù)后平均生存時間最短，腫瘤組織中AFP中表達者術(shù)后平均生存時間最長，腫瘤組織中AFP高表達者術(shù)后平均生存時間介于以上兩組之間。3組生存時間采用Newman-Keuls檢驗，AFP低表達組生存時間短于中、高表達組(P＜0.05)，而中、高表達組間生存時間無明顯差異(P＞0.05)。

表2 原發(fā)性肝細胞癌組織中AFP表達與預(yù)后的關(guān)系

2.5 肝癌組織與血清中AFP關(guān)系 將有術(shù)前血清AFP檢測值的61例患者癌組織的AFP表達情況和術(shù)前血清AFP檢測值描記成曲線后發(fā)現(xiàn)，癌組織中AFP表達與血清中AFP含量關(guān)系基本成正相關(guān)，曲線不完全一致，但大體走勢相同，呈兩頭低中間高(見圖1)。

圖1 HCC組織中AFP表達與血清AFP含量的關(guān)系

2.6 肝癌組織AFP表達與腫瘤大小的關(guān)系 由表3可見，AFP表達與腫瘤大小無關(guān)(P＞0.05)。

表3 原發(fā)性肝細胞癌的AFP表達與腫瘤大小的關(guān)系

3 討論

血清AFP檢測用于HCC的篩查首選已成共識。檢測方法有放射免疫法(RIA)和AFP單克隆抗體酶免法(EIA)快速測定法，陽性率為70% ～80%，用電化學(xué)發(fā)光法測定陽性率平均為76.2%。一般認為AFP＞400 μg/L時可對原發(fā)性肝癌確定診斷。臨床上對于原發(fā)性肝癌的高危人群，若血清AFP顯著升高，持續(xù)時間大于2個月，影像資料無論有無肝內(nèi)占位病變，都應(yīng)高度警惕存在原發(fā)性肝癌的可能，應(yīng)給密切觀察，因為血清AFP的陽性發(fā)現(xiàn)往往早于癥狀出現(xiàn)8～11個月［1］。肝細胞肝癌血清中的AFP水平高低與肝癌細胞分化程度有關(guān)，Ⅰ級肝癌細胞分化接近正常細胞，故AFP含量尚不足以測出，Ⅳ級由于分化極差，已失去類似胚胎細胞的機能，也不能從血清中檢出AFP，Ⅱ、Ⅲ級肝癌細胞認為是和胚胎肝細胞相似的幼稚細胞，產(chǎn)生AFP陽性率較高，因此肝細胞癌的分化程度不同，AFP含量存在差異。但有15%左右的原發(fā)性肝癌患者血清中AFP始終不高，故AFP不高者并不能排除原發(fā)性肝癌。

國外有報道AFP在HCC組織中的陽性率在44%～70%之間，常呈灶狀分布。在細胞內(nèi)的分布以核周型為主，也可表現(xiàn)為胞質(zhì)型、胞膜型和局限型，其陽性細胞數(shù)和免疫組化反應(yīng)強度大多與AFP血濃度、肝細胞癌的分化程度相關(guān)［2-5］。Niwa等［2］報道AFP mRNA水平在30例HCC的癌腫區(qū)比非癌區(qū)增加大約10～105倍，并且與血清AFP水平和腫瘤的大小均相關(guān)。Ohguchi等［3］也報道AFP的血清水平越高，表達它的HCC細胞群越大，在癌周組織中AFP僅有弱表達，而正常肝組織中為陰性。國內(nèi)的一項研究［6］結(jié)果表明，AFP在HCC組織中的表達有以癌巢分布的趨勢，雖然在肝硬化和癌周組織的部分細胞也可見AFP表達，但其陽性率和表達強度均低于HCC組織，且多為核陽性，伴不典型增生，提示這些細胞可能是癌前期細胞，它們可能已開始擁有腫瘤樣生長能力，但還缺乏惡性轉(zhuǎn)化的表型。AFP的表達可能和肝細胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)［2］。

囯內(nèi)李偉等［7］針對40例HCC患者的一項研究證實，AFP在肝癌內(nèi)的表達率為87.5%，癌旁組織為80.0%，但其強度反應(yīng)更高，充分說明不僅癌細胞內(nèi)存在AFP，癌旁非癌性組織中也出現(xiàn)了AFP陽性顆粒。還有研究表明HCC組織內(nèi)的AFP和癌旁組織的AFP二者的分子結(jié)構(gòu)具有異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為AFP分子中糖基的結(jié)構(gòu)及組成的差異，這種差異與能合成AFP的細胞特征及細胞處于不同的病理狀態(tài)有關(guān)，因此肯定HCC周圍病變組織可出現(xiàn)AFP陽性顆粒，從而提示HCC的發(fā)生發(fā)展與慢性肝病特別是肝硬化密切相關(guān)。

本課題發(fā)現(xiàn):(1)肝癌患者的血清AFP檢測值的高低與其癌組織 AFP的表達情況基本成正相關(guān)關(guān)系(曲線均為兩頭低中間高)。原因可能是:肝癌細胞分兩種，一種合成AFP，一種不合成AFP;AFP只在細胞周期的一定時期合成，不處于此期的癌細胞不合成AFP;高分化和明顯低分化癌細胞很少合成或不合成AFP;癌細胞嚴重影響AFP合成;癌組織中纖維間質(zhì)較多，AFP不易進入血液。(2)HCC組織中AFP表達與預(yù)后有關(guān)，AFP表達高者預(yù)后好，生存時間較長;反之，預(yù)后差，生存時間短?，F(xiàn)有的研究尚缺乏類似報道，筆者認為，這可能是高表達腫瘤患者在術(shù)后隨訪時血液中AFP再次顯著增高往往先于影像學(xué)發(fā)現(xiàn)肝癌復(fù)發(fā)而盡早被發(fā)現(xiàn)從而得到及時治療有關(guān)。病理分級較差且AFP低或不表達，多提示腫瘤呈顯著低或未分化，幾乎不分泌AFP，提示預(yù)后不良。

［1］Ozer B，Serin E，Yilmaz U，et al.Clinicopathologic features and risk factors for hepatocellular carcinoma:results from a single center in southern Turkey［J］.Turk J Gastroenterol，2003，14(2):85-90.

［2］Niwa Y，Matsumura M，Shiratori Y，et al.Quantitation of alpha-fetoprotein and albumin messenger RNA in human hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，1996，23(6):1384-1392.

［3］Ohguchi S，Nakatsukasa H，Higashi T，et al.Expression of alphafetoprotein and albumin genes in human hepatocellular carcinomas:limitations in the application of the genes for targeting human hepatocellular carcinoma in gene therapy［J］.Hepatology，1998，27(2):599-607.

［4］Tsutsumi T，Ido A，Nakao K，et al.Reciprocal regulation of alpha-fetoprotein and albumin gene expression by butyrate in human hepatoma cells［J］.Gastroenterology，1994 ，107(2):499-504.

［5］張新立，史景泉，左聲鶴.ras癌基因產(chǎn)物P21與腫瘤胚胎蛋白AFP、CEA在人肝癌中表達的對比研究［J］.中華病理學(xué)雜志，1994，(3):155-158.

［6］翟守恒，劉俊彬，劉云梅等.HBsAg，HCV-Ag和AFP在肝硬變和肝細胞癌組織中的表達［J］.世界華人消化雜志，2000，8(5):524-527.

［7］李偉，王學(xué)春，李星，等.肝癌及癌旁組織中 P53基因及 AFP、CEA等表達異常及相關(guān)性研究［J］.中國腫瘤臨床與康復(fù)，2002，9(2):3-5.