腦心通對大鼠腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡的影響

郭合伏

河南省濮陽市中原油田第三社區(qū)第二醫(yī)院，河南濮陽 457321

腦心通對大鼠腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡的影響

郭合伏

河南省濮陽市中原油田第三社區(qū)第二醫(yī)院，河南濮陽 457321

目的 探討腦心通對大鼠腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡的保護作用。方法 應(yīng)用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型。將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、低劑量組和高劑量組，各組分別于術(shù)前3d和術(shù)后給予不同劑量藥物灌胃，術(shù)后24、48、72、96 h,取腦組織進行HE染色、TTC染色、測定Caspase-3表達的動態(tài)變化。結(jié)果 腦心通低、高劑量組均能減少大鼠腦梗死體積 （P<0.05），減少Caspase-3陽性細胞表達。結(jié)論 腦心通膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡有保護作用。

腦心通；腦缺血再灌注損傷；Caspase-3

缺血再灌注損傷是腦梗死發(fā)生后重要的病理生理過程，如何減輕缺血再灌注損傷是目前研究的熱點之一。臨床研究表明，腦心通治療氣虛血瘀，脈絡(luò)閉阻所致腦卒中臨床療效確切[1]。但其對急性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡保護作用的研究尚未見報道。該實驗擬采用大鼠腦缺血再灌注模型，應(yīng)用腦心通干預(yù)模型大鼠，探討其治療缺血性腦血管病的可能機制。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級健康SD大鼠，雌雄不拘，鼠齡3～4個月，體重250～300 g。由河南省實驗動物中心提供。

1.2 藥物和試劑

腦心通膠囊粉由陜西咸陽步長制藥有限公司提供 （批號：20050619），1 g粉含飲片1 g，臨用時以蒸餾水制成需要濃度的混懸液；紅四氮唑（TTC）為北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；Caspase-3－抗：兔抗鼠單克隆抗體，DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 實驗方法

2.1 造模及神經(jīng)功能行為學(xué)評分

模型的制備參照Zea Longa[2]線栓法制作大鼠腦缺血再灌注模型。

2.2 分組與取材

造模成功的實驗動物120只隨機平均分為4組，即假手術(shù)組、模型組、低劑量組（100 mg/kg）和高劑量組(400 mg/kg)。每組按24、48、72、96 h分為不同的時間點，每時間點6只。動物先連續(xù)灌胃3 d，每天2次，第4天造模。術(shù)后繼續(xù)灌胃直至相應(yīng)的時間點斷頭取腦。假手術(shù)組和模型組依同樣的方法給予生理鹽水灌胃，直至斷頭取腦。腦組織固定后石蠟包埋，切片待用。另取12只相應(yīng)分成4組，每組3只，均在造模24 h后斷頭取腦做TTC染色。

2.3 腦梗死體積的測定

大鼠在腦缺血再灌注后24 h斷頭取腦，2%TTC染色，數(shù)碼照相攝影，計算機圖像分析系統(tǒng)分析梗死體積。

2.4 免疫組化染色

Caspase-3免疫組化染色采用SABC法。相鄰切片行常規(guī)HE染色，光鏡觀察組織學(xué)變化情況。

2.5 結(jié)果判定

腦片TTC染色后可見正常腦組織為玫瑰紅色，缺血梗死區(qū)為蒼白色。免疫陽性細胞被染成棕黃色，Caspase-3陽性細胞為胞漿染色，少數(shù)胞核也染色。

記數(shù)方法：每個大鼠隨機任選2張切片，任選腦缺血半暗帶區(qū)5個視野進行攝像分析，測量每個視野單位面積內(nèi)陽性細胞數(shù)，再記算該切片平均陽性細胞數(shù)。

2.6 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 腦心通對腦缺血再灌注大鼠的病理改變的影響

HE染色假手術(shù)組未見梗死灶，神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；模型組鏡下見缺血中心區(qū)無神經(jīng)元，僅見少量膠質(zhì)細胞，細胞間質(zhì)空泡樣改變。低劑量腦心通組與高劑量腦心通組鏡下見缺血中心區(qū)變小，邊緣區(qū)神經(jīng)元變性、壞死減少，多數(shù)存活細胞形態(tài)相對正常。

3.2 腦心通對腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響

與模型組大鼠相比較，低劑量組和高劑量組在缺血2 h再灌注24 h均明顯減少大鼠的腦梗死體積，結(jié)果見表1。

表1 腦心通對缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響（±s）

表1 腦心通對缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響（±s）

注：與模型對照組相比*P<0.05，**P<0.01。

分組 腦梗死體積占同側(cè)半球體積的百分比（%）假手術(shù)組 模型組 低劑量腦心通組 高劑量腦心通組再灌注24h 0±0**16.52±3.6110.27±4.36* 7.65±2.63*

3.3 腦心通對腦缺血再灌注大鼠Caspase-3蛋白表達的影響

與模型組相比，高、低劑量組除0h外，Caspase-3陽性細胞表達減少，結(jié)果見表2。

4 討論

Caspase-3是細胞凋亡程序中關(guān)鍵的同源半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡過程中屬中心地位。最近研究報道，Caspase家族在細胞凋亡中具有中心效應(yīng)，Caspase-3處于表面死亡受體被激活或細胞內(nèi)死亡信號存在的情況下，始動的Caspase-3活化并引發(fā)下游效應(yīng)，Caspase蛋白水解激活的級聯(lián)反應(yīng)，使一系列骨架蛋白及細胞修復(fù)酶等靶蛋白裂解導(dǎo)致細胞凋亡，Caspase-3的表達表明細胞必定死亡。因此Caspase-3被稱為死亡蛋白酶，是哺乳動物凋亡的關(guān)鍵酶。

腦心通由黃芪、丹參、當歸等16味中藥組成，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)、醒腦開竅、宣痹止痛之功效，臨床用于治療腦梗死、冠心病、血管性癡呆等取得了較好的療效。用藥后患者神經(jīng)功能改善明顯，生活質(zhì)量提高，血液流變學(xué)有明顯改變，為臨床防治腦卒中的有效藥物[3]。

結(jié)果表明高、低劑量的腦心通均能明顯減輕腦缺血再灌注大鼠腦缺血區(qū)神經(jīng)細胞損傷，減輕病變區(qū)神經(jīng)細胞凋亡，且神經(jīng)細胞凋亡與Caspase-3的表達呈正相關(guān)，提示腦心通減少大鼠缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細胞的凋亡和減少Caspase-3的表達有關(guān)。

表2 腦心通對腦缺血再灌注大鼠Caspase-3蛋白表達的影響（±s）

表2 腦心通對腦缺血再灌注大鼠Caspase-3蛋白表達的影響（±s）

注：與模型對照組相比*P<0.05，**P<0.01。

分組假手術(shù)組模型組低劑量腦心通組高劑量腦心通組劑量生理鹽水4 mL生理鹽水4 mL 100 mg/kg 400 mg/kg再灌注0 h 2.15±0.55 2.42±1.23 3.14±0.96 2.54±1.33再灌注24 h 2.17±0.75**17.60±6.09 11.32±4.63*7.46±5.56*再灌注48 h 2.54±1.13**16.58±5.69 11.33±5.32*6.74±4.36*再灌注72 h 再灌注96 h 3.22±0.56**13.67±4.90 8.69±5.46*4.38±3.96*2.46±1.13**7.69±2.13 4.97±3.21*2.76±1.89*

[1]王華卿，劉林強，孫海業(yè).步長腦心通治療缺血性腦血管病療效觀察[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001（8）：720.

[2]Zea longa E,Weinstein PR,Canson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlussion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1)：84-91.

[3]方正龍，袁燦興，顏乾麟，等.步長腦心通膠囊治療腦卒中的臨床研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2003，1（1）：32-34.

Naoxintong on neuronal apoptosis opter cerebral ischemia

GUO Hefu
Secord Hospital of zhong yuan oilfieid,Puyan city,Hennan Province,the third communty,Henan 457321,China

ObjectiveTo investigate the protective effects of Naoxintong Capsules(NCs)against the cerebral damage in the rat experienced cerebral reperfusion.MethodsThe rat model ofcerebral reperfusion with thread embolism was made.RatsultsRandomly divided into four groups:sham operation group,model group,low does treatment group and high does treatment group.Each group was given difference does medicine three days before the operation and after the operation.At the time of 24h、48h、72h and 96h after opration,the cerebral infarct size， the expression of Caspase-3 were observed,HE staining,TTC staining and Immunohistochemistry technique.Results NCs low does and high does all could reduce the cerebral infarct size(P<0.05);reduce the expression of Caspase-3(P<0.05)in the rats.ConclusionThe results suggest that NCs posses protective effects against the cerebral damage caused by cerebral reperfusion.

Naoxintong;Model of reperfusion;Caspase-3

R285

A

1674-0742（2012）07（c）－0027-02

2012-06-09）