CXCL12和CXCR4在人星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義*

劉海巍,陶勝忠,牛光明,周 興,牛國策,孫所輝

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,鄭州 450014)

星形細(xì)胞瘤是最常見的神經(jīng)上皮性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的13.0%～26.0%，占膠質(zhì)瘤的21.2%～51.6%[1]。目前以手術(shù)治療為主，輔以放療、化療等的綜合治療，雖然取得了一定的臨床效果，但并未從根本上提高星形細(xì)胞瘤患者的總體預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL12及其受體CXCR4構(gòu)成的CXCL12/CXCR4信號(hào)通路可能與人膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，本文初步探討CXCL12和CXCR4在人星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1材料 選取本院神經(jīng)外科2010年3月至2011年7月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為星形細(xì)胞瘤標(biāo)本48例(腫瘤組)。所有患者手術(shù)前均未經(jīng)放療、化療等治療。其中男31例，女17例；年齡7～68歲，平均41.7歲。根據(jù)2007年WHO關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分級(jí),Ⅰ級(jí)8例，Ⅱ級(jí)17例，Ⅲ級(jí)16例，Ⅳ級(jí)7例。12例非瘤組織均取自顱腦損傷等行減壓術(shù)患者(非瘤組)。標(biāo)本離體30 min內(nèi)迅速放入液氮罐中，后轉(zhuǎn)入―80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(reverse transcription polym-erase chain reaction,RT-PCR)半定量檢測(cè)CXCL12 mRNA和CXCR4 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平 CXCL12引物：上游5′-TAG TGC CTC CAT GGC ATA CA- 3 ′，下游5′-GAT GTG TAA TGG TCC CCC TG-3 ′，擴(kuò)增片段長度為138 bp；CXCR4引物：上游5′-TGA CTC CAT GAA GGA ACC CTG-3′，下游5′- CTT GGC CTC TGA CTG TTG GTG-3′,擴(kuò)增片段長度381 bp；內(nèi)參β-actin：上游5′-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A- 3′，下游5′-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA -3′，擴(kuò)增片段長度為318 bp。取PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后攝像，采用相對(duì)積分光密度(RIOD)表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。所用的引物及β-actin均購自鄭州鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.3免疫組化SP法檢測(cè)CXCL12蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá)水平 采用免疫組化SP法檢測(cè)CXCL12和 CXCR4蛋白，兔抗人CXCL12多克隆抗體(Abcam公司)，兔抗人CXCR4多克隆抗體(R&D 公司)，免疫組化試劑盒(鄭州鼎國生物技術(shù)有限公司)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：CXCL12和 CXCR4多表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜， 隨機(jī)選10個(gè)高倍視野,依照細(xì)胞著色密度和著色強(qiáng)度半定量評(píng)分。(1)染色細(xì)胞百分比：未見染色為0分，≤25%細(xì)胞染色為1分，25%～50%細(xì)胞染色為2分,<50%細(xì)胞染色為3分；(2)依陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度：未見染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，上述兩者之和的總得分來判定結(jié)果， >2分定義為陽性表達(dá)(+)， ≤2分定義為陰性表達(dá)(-)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件包處理數(shù)據(jù)，兩獨(dú)立定量樣本之間的比較用t檢驗(yàn)，相關(guān)性用Pearson積矩相關(guān)系數(shù)表示。兩組分類變量之間的比較和相關(guān)性分析用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CXCL12 mRNA和CXCR4 mRNA的表達(dá) CXCL12 mRNA和CXCR4 mRNA在非瘤組和腫瘤組中的表達(dá)見表1，圖1、2。CXCL12 mRNA和CXCR4 mRNA在腫瘤組中的表達(dá)高于在非瘤組中的表達(dá)(P<0.05)；在Ⅲ～Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)高于在Ⅰ～Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)(P<0.05)。Pearson積矩相關(guān)系數(shù)表明CXCL12 mRNA和CXCR4 mRNA的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.697，P<0.05)。

表1 CXCL12 mRNA和CXCR4 mRNA在各組患者中的表達(dá)情況

△:P<0.05,與非瘤組比較；☆：P<0.05，與Ⅰ～Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織比較。

M：Marker；Ⅰ：Ⅰ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織；Ⅱ：Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織；Ⅲ：Ⅲ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織；Ⅳ：Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織。

圖1 CXCL12 mRNA電泳圖

表2 CXCL12蛋白和CXCR4蛋白在各組中的表達(dá)情況

△:P<0.05,與非瘤組比較；☆：P<0.05，與Ⅰ～Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織比較。

2.2CXCL12蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá) 見表2。CXCL12蛋白和CXCR4蛋白在腫瘤組中的表達(dá)高于非瘤組的表達(dá)(P<0.05)。CXCL12蛋白和CXCR4蛋白在Ⅲ～Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)高于在Ⅰ～Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)(P<0.05)。且CXCL12蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.499，P<0.05)。

M：Marker；Ⅰ：Ⅰ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織；Ⅱ：Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織；Ⅲ：Ⅲ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織；Ⅳ：Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織。

圖2 CXCR4 mRNA電泳圖

3 討 論

CXCL12 屬于趨化因子CXC亞家族,首先在P6系小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子中被發(fā)現(xiàn)，CXCR4是存在于胞膜上的具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白藕聯(lián)受體。CXCL12與CXCR4具有高度的親和力，CXCL12與CXCR4的N端特異性結(jié)合并與CXCR4第 2胞外環(huán)相互作用才能啟動(dòng)下游信號(hào)，啟動(dòng)基因表達(dá)和細(xì)胞周期進(jìn)程的改變，引起趨化性、細(xì)胞增殖和基因轉(zhuǎn)錄等多種反應(yīng)。

本研究檢測(cè)了CXCL12和CXCR4在非瘤腦組織和星形細(xì)胞瘤各病理級(jí)別組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示CXCL12和CXCR4在星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)明顯高于在非瘤腦組織中的表達(dá)，它們的表達(dá)水平隨星形細(xì)胞瘤病理級(jí)別的升高而升高，并且二者的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)。這些表明CXCL12和CXCR4構(gòu)成的CXCL12/CXCR4信號(hào)通路與星形細(xì)胞瘤的惡性發(fā)展和惡性程度均有密切的關(guān)系，可能是星形細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展進(jìn)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

Barbero等[2]發(fā)現(xiàn)外源性的CXCL12能誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與ERK的活化相聯(lián)系，并且CXCL12 能誘導(dǎo)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等遷移到腫瘤組織，這些細(xì)胞不但參與了腫瘤環(huán)境的炎癥和免疫反應(yīng)，還能產(chǎn)生多種生物因子刺激腫瘤的生長，并通過產(chǎn)生促血管生成因子刺激血管的生成從而促進(jìn)腫瘤的增殖。CXCL12還能通過激活核因子-κB(NF-κB)來抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的產(chǎn)生和腫瘤細(xì)胞的凋亡間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)表明高級(jí)別膠質(zhì)瘤中CXCL12和CXCR4的表達(dá)較低級(jí)別膠質(zhì)瘤及正常腦組織均明顯升高。CXCL12是不具有谷氨酰胺-亮氨酸-精氨酸序列的趨化因子，但卻顯示較強(qiáng)出血管生成的活性。體內(nèi)病理濃度的CXCL12在伴有低濃度的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的情況下能有效誘導(dǎo)血管的生成[3]，這揭示了它們之間存在巨大的協(xié)同作用，其機(jī)制可能與CXCL12和 CXCR4 結(jié)合后通過 PI3K/Akt途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放 VEGF有關(guān)。此外，CXCL12能吸引樹突狀細(xì)胞進(jìn)入腫瘤環(huán)境，然后腫瘤樹突狀細(xì)胞可依次通過產(chǎn)生IL-8和TNF-α誘導(dǎo)血管的生成[4]。同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞的移行在很大程度上依賴于CXCL12，血管內(nèi)皮細(xì)胞可沿著CXCL12遷移并以依賴CXCL12的方式誘導(dǎo)腫瘤血管的生成。CXCL12 還可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)抑制纖溶酶原激活物(PA)來發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤增殖和血管發(fā)生的作用[5]。研究還顯示，在CXCL12抗體存在的情況下非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的轉(zhuǎn)移在很大程度上被抑制了[6]，并且在細(xì)胞表面阻斷CXCR4的表達(dá)能極大降低腫瘤細(xì)胞向肝臟和肺臟的轉(zhuǎn)移，在腫瘤經(jīng)常轉(zhuǎn)移的器官如淋巴結(jié)、肺臟、肝臟和骨髓等中發(fā)現(xiàn)表達(dá)有較高水平的CXCL12[7]。腫瘤的散播可以被看為涉及細(xì)胞外基質(zhì)降解的過程，金屬蛋白酶(MMPs)能使周圍正常組織的細(xì)胞外基質(zhì)降解并能介導(dǎo)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。許多研究證實(shí)，在多種腫瘤細(xì)胞中CXCL12能誘導(dǎo)MMPs的合成和腫瘤細(xì)胞的粘附來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[8]。CXCL12和CXCR4在一些腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)也許暗示著CXCL12/CXCR4信號(hào)通路在引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向特定器官的轉(zhuǎn)移中方面發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。

目前通過阻斷CXCL12和CXCR4的相互作用和抑制下游細(xì)胞內(nèi)酶的活性，CXCL12/CXCR4信號(hào)通路已成為相關(guān)疾病治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。CXCR4拮抗劑——AMD3100的安全性、耐受性和有效性在臨床實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到證實(shí)[9]。臨床試驗(yàn)顯示非霍奇金淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤患者在應(yīng)用AMD3100和G-CSF后與單獨(dú)應(yīng)用G-CSF相比，更多的患者收集到了最佳數(shù)量的干細(xì)胞用于自體移植[10]。CXCL12拮抗劑類似物CTCE-9908在小鼠的乳腺癌模型中能降低腫瘤的轉(zhuǎn)移和原發(fā)腫瘤的生長，并能在小鼠的前列腺癌模型中減小腫瘤的體積[11]。

本研究認(rèn)為在星形細(xì)胞瘤中存在CXCL12和CXCR4的高表達(dá)，其表達(dá)水平與病理級(jí)別密切聯(lián)系，并且二者的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)。檢測(cè)CXCL12和CXCR4的表達(dá)水平可能對(duì)臨床治療和判斷星形細(xì)胞瘤病理級(jí)別、分化程度及預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。

[1]王忠誠.王忠誠神經(jīng)外科學(xué)[M].武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社,2005：541.

[2]Barbero S,Bonavia R,Bajetto A,et al.Stromal cell-derived factor 1 stimulates human glioblastoma cell growth through the activation of both extracellular signal-regulated kinases 1/2 and Akt[J].Cancer Res,2003,63(8)：1969-1974.

[3]Kryczek I,Lange A,Mottram P,et al.CXCL12 and vascular endothelial growth factor synergistically induce neoangiogenesis in human ovarian cancers[J].Cancer Res,2005,65(2)：465-472.

[4]Curiel TJ,Cheng P,Mottram P,et al.Dendritic cell subsets differentially regulate angiogenesis in human ovarian cancer[J].Cancer Res,2004,64(16)：5535-5538.

[5]Oh JW,Olman M,Benvenise EN.CXCL12-Mediated induction plasminogen activator inhibitor-1 expression in human CXCR4 positive astroglioma cells[J].Biol Pharm Bull,2009,32(4):573-577.

[6]Phillips RJ,Burdick MD,Lutz M,et al.The stromal derived factor-1/ CXCL12- CXC chemokine receptor 4 biological axis in non-small cell lung cancer metastases[J].Am J Respir Crit Care Med,2003,167(12)：1676-1686.

[7]Muller A,Homey B,Soto H,et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J].Nature,2001,410(6824)：50-56.

[8]Klier CM,Nelson EL,Cohen CD,et al.Chemokine-induced secretion of gelatinase B in primary human monocytes[J].Biol Chem,2001,382(9)：1405-1410.

[9]DiPersio JF,Micallef IN,Stiff PJ,et al.Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony- stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkins lymphoma[J].J Clin Oncol,2009，27(28):4767-4773.

[10]DiPersio JF,Stadtmauer EA,Nademanee A,et al.Plerixafor and G-CSF versus placebo and G-CSF to mobilize hematopoietic stem cells for autologous stem transplantation in patients with multiple myeloma[J].Blood,2009,113(23)：5720-5726.

[11]Porvasnik S,Sakamoto N,Kusmartsev S,et al.Effects of CXCR4 antagonist CTCE-9908 on prostate tumor growth[J].Prostate,2009,69(13):1460-1469.