黃芪多糖對力竭運(yùn)動大鼠心肌細(xì)胞凋亡及BcL－2、Bax蛋白表達(dá)的影響

馬蘭軍，田振軍

（1.西安建筑科技大學(xué) 體育系，西安 710055；2.陜西師范大學(xué) 體育學(xué)院，西安 710062）

黃芪多糖對力竭運(yùn)動大鼠心肌細(xì)胞凋亡及BcL－2、Bax蛋白表達(dá)的影響

馬蘭軍1＊，田振軍2

（1.西安建筑科技大學(xué) 體育系，西安 710055；2.陜西師范大學(xué) 體育學(xué)院，西安 710062）

為了探討黃芪多糖（APS）對力竭運(yùn)動大鼠機(jī)體的保護(hù)作用，通過建立大強(qiáng)度力竭運(yùn)動大鼠模型，選取成年健康雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為安靜對照組，運(yùn)動組和運(yùn)動加藥組，運(yùn)動組和運(yùn)動加藥組按照訓(xùn)練模型進(jìn)行為期6周的耐力訓(xùn)練，最后1次訓(xùn)練進(jìn)行1次力竭運(yùn)動，隨后取心肌組織并進(jìn)行樣本處理.檢測大鼠心肌MDA含量，用缺口末端標(biāo)記法（TUNEL法）及免疫組織化學(xué)法檢大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）及BcL－2、Bax蛋白表達(dá)的變化.結(jié)果表明：運(yùn)動組MDA含量、AI和BcL－2、Bax蛋白表達(dá)水平均明顯高于安靜對照組（P＜0.05）；與運(yùn)動組比較，運(yùn)動加藥組 MDA含量，AI與Bax蛋白表達(dá)水平均下降，而BcL－2蛋白表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05）.黃芪多糖可有效抑制力竭運(yùn)動大鼠心肌細(xì)胞凋亡，此作用可能與其減輕氧化應(yīng)激、上調(diào)BcL－2和下調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平有關(guān).

黃芪多糖；力竭運(yùn)動；心??；細(xì)胞凋亡；BcL－2蛋白；Bax蛋白

大強(qiáng)度急性力竭運(yùn)動過程中，隨著運(yùn)動強(qiáng)度的增加導(dǎo)致機(jī)體血液重新分布，心臟血流急驟下降，同時由于能量物質(zhì)耗竭、代謝產(chǎn)物堆積及氧化應(yīng)激所造成的自由基損傷等多種因素的影響，機(jī)體運(yùn)動能力下降，出現(xiàn)運(yùn)動性疲勞，從而引起體細(xì)胞凋亡.心肌是終末分化細(xì)胞，故一定程度的細(xì)胞凋亡可能會使心肌遭受嚴(yán)重的損傷并導(dǎo)致永久性的功能障礙.如何避免心肌損傷己成為運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要研究內(nèi)容.

黃芪為豆科植物膜莢黃芪及蒙古黃芪的根，近年來的研究發(fā)現(xiàn)黃芪中含多糖、皂苷、黃酮、氨基酸等多種有效成分，其中黃芪多糖（APS）經(jīng)過高科技萃取、分離而得到，可作為免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑，同時具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗應(yīng)激、抗氧化等作用［1-2］.但黃芪多糖對急性力竭運(yùn)動大鼠心肌細(xì)胞是否有保護(hù)作用研究不多.本研究旨在采用急性大強(qiáng)度力竭運(yùn)動大鼠心肌細(xì)胞損傷模型，觀察其對心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控基因BcL－2、Bax的變化，探討黃芪多糖對力竭運(yùn)動大鼠心肌細(xì)胞保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥在臨床上防治心肌缺血、缺氧性疾病和抗運(yùn)動疲勞的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象及分組

健康雄性SD大鼠（購于陜西中醫(yī)研究所）24只，3月齡，體重252±13g，所有動物按國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料分籠飼養(yǎng)，每籠6只，自由飲食飲水.室溫控制在18℃～23℃，相對濕度40%～60%，自然光照.實(shí)驗(yàn)室隔天用消毒液消毒.將24只大鼠隨機(jī)分為3組：安靜對照組（安靜組）、大強(qiáng)度耐力運(yùn)動組（運(yùn)動組）、大強(qiáng)度耐力運(yùn)動＋黃芪多糖組（運(yùn)動加藥組），每組8只，安靜組和運(yùn)動組每天灌胃生理鹽水0.1mL／10g，1次，運(yùn)動加藥組每天灌胃黃芪多糖（購于長沙綠康生物制品有限公司）0.1mL／10g，1次，實(shí)驗(yàn)時間6周.

1.2 力竭運(yùn)動模型

實(shí)驗(yàn)動物正式實(shí)驗(yàn)前，在國產(chǎn)跑臺上作5min的適應(yīng)性訓(xùn)練（速度8.2m／min坡度為0）.正式實(shí)驗(yàn)時，運(yùn)動組和運(yùn)動加藥組大鼠采用Benford［3］根據(jù)大鼠體重／攝氧量回歸方程建立遞增負(fù)荷跑臺運(yùn)動疲勞模型，訓(xùn)練持續(xù)6周，每周6d，周日休息.先進(jìn)行1周適應(yīng)性訓(xùn)練，逐漸提高運(yùn)動強(qiáng)度至80%VO2max以上，最后1d運(yùn)動至力竭（表1）.運(yùn)動時用聲光刺激或者用毛刷刺激動物尾部，使動物保持在跑臺前部1／3處，以保證運(yùn)動強(qiáng)度.力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)：動物未能堅(jiān)持原跑速，跑的姿勢由開始時的蹬地跑變?yōu)榘肱P位跑，腹部與跑道時有接觸，甚至為臥位跑，到運(yùn)動末期，大鼠先后滯留跑道后1／3處達(dá)3次以上，各種刺激驅(qū)趕均無效，停跑后體征表現(xiàn)為呼吸急促、神情倦怠、腹臥位，對刺激反應(yīng)遲鈍，捕捉時逃避反應(yīng)較運(yùn)動前減弱［4-5］.

表1 實(shí)驗(yàn)動物運(yùn)動方案Tab.1 Experimental animal movements scheme

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器 SHH·W21·600三用電熱恒溫水箱，UV－9200紫外可見光光度計(jì)，TGL－16C臺式高速離心機(jī)，PT動物電動跑臺，820輪轉(zhuǎn)組織切片機(jī)（美國AO公司）；鼠源Bax一抗和鼠二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；OLYMPUSBX52顯微照相圖像采集系統(tǒng)（日本奧林巴斯株式會社）.

1.3.2 取材及樣品制備 在運(yùn)動期的最后1d，安靜組大鼠用20%烏拉坦（0.5mL／kg體重）腹腔麻醉后，打開胸腔，立即取出心臟待用.運(yùn)動組和運(yùn)動加藥組大鼠進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動，在力竭運(yùn)動后即刻麻醉處死，取材待用（方法同安靜組）.

心肌線粒體懸液的制備：采用差速離心法.取大鼠心肌用介質(zhì)Ⅰ（0.125mol／L蔗糖溶液，3.0mmol／L n－2－羥乙基呱嗪－n－2－乙磺酸，0.5mmol／L乙二胺四乙酸，pH＝7.4）沖洗凈血污，剔除結(jié)締組織，剪碎，加20mL介質(zhì)電動勻漿器勻漿，放入離心管中離心，2 500r／min，5min，取上清液于12 000r／min離心，10min，沉淀用介質(zhì)Ⅱ（0.25mol／L蔗糖溶液，2.0mmol／Ln－2－羥乙基呱嗪－n－2－乙磺酸，0.5mmol／L 乙二胺四乙酸，pH＝7.4）懸浮，手動勻漿器勻漿，加入2mL介質(zhì)Ⅱ，12 000r／min離心，10min，沉淀懸浮在0.5mL介質(zhì)Ⅱ中，制備成線粒體懸液.

1.4 測試指標(biāo)及方法

1.4.1 測試指標(biāo) BCA法蛋白定量試劑盒和MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒POD（No.MK1020，武漢博士德生物工程有限公司）；抗BcL－2多克隆抗體；抗Bax多克隆抗體.

1.4.2 測定方法 心肌 MDA含量測定：切取左室全層心肌，4℃，10%勻漿，低溫離心取上清，－70℃凍存.按試劑盒說明，采用bicinchoninicacid（BCA）法進(jìn)行蛋白定量，硫代巴比妥酸法測MDA含量.

心肌細(xì)胞凋亡、BcL－2和Bax蛋白表達(dá)測定：切取2.5mm厚全層心室肌，4%多聚甲醛固定16～20h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm.用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測凋亡晚期特征性的細(xì)胞核DNA片段，以試劑盒提供的陽性對照片作為陽性對照，操作過程用PBS代替脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶作為陰性對照.凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核為深淺不一的棕黃色或棕褐色，非凋亡細(xì)胞呈藍(lán)色.采用鏈霉親和素－生物素－過氧化物酶復(fù)合法檢測心肌細(xì)胞BcL－2與Bax的蛋白表達(dá).在陰性對照操作中不加抗BcL－2和抗Bax抗體.蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞的胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色，細(xì)胞核藍(lán)染.將TUNEL與免疫組切片于光鏡下400倍放大，數(shù)碼相機(jī)拍攝，圖像經(jīng)OLYMPUSBX52圖文分析系統(tǒng)分析，每張切片隨機(jī)選擇10個視野，測定陽性染色的平均吸光度（A）和陽性細(xì)胞百分比，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）：AI（%）＝平均吸光度×陽性細(xì)胞百分比.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS12.0for Windows軟件包進(jìn)行處理.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析（One－Way ANOVA）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）.顯著性差異選擇P＜0.05和P＜0.01.

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖對急性力竭運(yùn)動大鼠心肌細(xì)胞MDA含量的影響

表2結(jié)果顯示，運(yùn)動組比安靜對照組心肌MDA含量明顯增高，運(yùn)動加藥組比運(yùn)動組MDA含量明顯降低（P＜0.05）.

2.2 黃芪多糖對急性力竭運(yùn)動大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

表2結(jié)果顯示，TUNEL檢測結(jié)果顯示安靜對照組凋亡細(xì)胞極少，運(yùn)動組凋亡細(xì)胞明顯增多，運(yùn)動加藥組比運(yùn)動組凋亡顯著降低（P＜0.05）.

2.3 黃芪多糖對急性力竭運(yùn)動大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白BcL－2、Bax表達(dá)的影響

表2結(jié)果顯示，安靜對照組中BcL－2、Bax蛋白表達(dá)水平較低；運(yùn)動組與安靜對照組相比，BcL－2、Bax蛋白表達(dá)均明顯增加（均P＜0.05）；與運(yùn)動組比較，運(yùn)動加藥組BcL－2蛋白表達(dá)明顯增加，Bax蛋白表達(dá)顯著降低（均P＜0.05）.

表2 各組大鼠心肌MDA含量、AI和BcL－2、Bax平均吸光度值（X±S，n＝8）Tab.1 The rat myocardial MDA content，AI and Bcl－2，Bax awerage absoroance valne（x±s，n＝8）

3 分析與討論

在急性力竭運(yùn)動中會伴有大量心肌細(xì)胞凋亡，從而加重了心肌的破壞，這與力竭所致的氧自由基及細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)［6］.

實(shí)驗(yàn)利用大鼠運(yùn)動力竭模型，研究黃芪多糖對運(yùn)動力竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及BcL－2、Bax蛋白表達(dá)的影響.結(jié)果顯示APS可明顯減輕因運(yùn)動力竭導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，BcL－2蛋白表達(dá)增高、Bax蛋白表達(dá)降低，同時MDA的含量降低.

研究證實(shí)，APS具有抗自由基損傷，保存胞內(nèi)ATP含量，減輕鈣超載等多種生物學(xué)效應(yīng)［7］.實(shí)驗(yàn)中APS有減少心肌細(xì)胞凋亡的作用，這可能與其抗自由基的作用有關(guān).氧自由基可直接造成DNA損傷或激活凋亡發(fā)生過程的關(guān)鍵物質(zhì)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡［8］；除此之外，氧自由基通過使還原物質(zhì)耗竭及合成受阻而改變胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，修飾刺激信號或活化與凋亡有關(guān)的關(guān)鍵蛋白等間接方式來誘導(dǎo)凋亡.氧自由基還會以間接方式介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中涉及線粒體、蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑.MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度［9-10］.本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明APS具有明顯的抗自由基作用.

BcL－2家族蛋白在細(xì)胞凋亡過程中具有雙向調(diào)節(jié)作用.在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞有序而協(xié)調(diào)地激活凋亡誘導(dǎo)基因和凋亡抑制基因共同控制著細(xì)胞代謝功能，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡.Bax是一種促凋亡基因，含有BH1到BH3 3個結(jié)構(gòu)域，分布于線粒體外膜，通過作用于線粒體引起細(xì)胞凋亡.Bax蛋白以非活性形式存在于胞質(zhì)中，在凋亡誘導(dǎo)因素作用下發(fā)生構(gòu)型變化，從細(xì)胞質(zhì)移位到線粒體膜與BcL－2形成異源二聚體抑制BcL－2的活性，使mPTP不可逆開放，啟動和維持細(xì)胞凋亡的“線粒體途徑”.而BcL－2是一種凋亡抑制基因，BcL－2和Bax的比率可決定細(xì)胞對凋亡信號的敏感性.BcL－2蛋白具有穩(wěn)定mPTP的作用，使mPTP的功能保持正常［11］.BcL－2蛋白分布于線粒體外膜的漿膜面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜.它含有BH1到BH4 4個結(jié)構(gòu)域，具有穩(wěn)定線粒體膜的功能，阻止線粒體釋放caspase及活性因子 AIF、Cyt c等.BcL－2能抑制Bax和Bad等從胞質(zhì)向線粒體膜的移位；抑制Bax形成異源二聚體和寡聚體，抑制Bax與VDAC的相互作用，阻斷Bax的成孔活性.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)運(yùn)動組大鼠心肌BcL－2和Bax蛋白表達(dá)均增高，這可能是心肌在力竭運(yùn)動過程中損傷和抗損傷相互拮抗的一種表現(xiàn)，BcL－2受到某種抑制因素的作用，使Bax促凋亡作用最終占優(yōu)從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡［12］.APS能夠減少因運(yùn)動力竭所致的心肌細(xì)胞凋亡，其作用的機(jī)制可能與抗自由基損傷、上調(diào)BcL－2和下調(diào)Bax蛋白表達(dá)有關(guān)，至于其具體的分子機(jī)制或信號傳導(dǎo)途徑尚需進(jìn)一步深入研究.

［1］毛淑梅，李承德，王 琳，等.黃芪多糖對糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制的研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（9）：1227－1229.

［2］尹艷艷，李衛(wèi)平，王紹斌，等.黃芪提取物對大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷后炎癥因子及細(xì)胞凋亡的作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2005，21（12）：1486－1489.

［3］Bedford T G，Tipton C M，Wilson N C，et al.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures［J］.J App Physiol，1979，47（6）：1278－1283.

［4］李善妮.急性力竭運(yùn)動對大鼠肝細(xì)胞損傷及凋亡的影響［D］.長沙：湖南師范大學(xué).2005.

［5］李善妮，翟樹林，湯長發(fā).急性不同強(qiáng)度至力竭運(yùn)動對大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響［J］.北京體育大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29（5）：634－636.

［6］金其貫，鄧榮華.過度訓(xùn)練對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2000，19（4）：356－359.

［7］Mu Y L，Xie Y Y，Zhou L，et al Cardioprotective effect of methy lamine irisolidone，a new compound，in hypoxia／reoxygenation injury in cultured rat cardiacmyocytes［J］.Chem Biodivers，2009，6（8）：1170－1177.

［8］Danz E D，Skramsted J，Henry N，et al.Resveratrol prevents doxo－rubicin cardiotoxicity through mitochondrial stabilization and the Sirt1pathway［J］.Free Radic BiolMed，2009，46（12）：1589－1597.

［9］Coudray C，Pucheu S，Boucher F，et al.Effect of ischemia／reperfu－sion sequence on cytosolic iron status and its release in the coro－nary effluect in isolated rathearts［J］.Biol Trace Elem Res，1994，41（1－2）：69－75.

［10］Gao F，Gong B，Christopher T A，et al.Anti－apoptotic effect ofBe－nidipine，a long lasting vasodilating calcium antagonist，in ische－mic－reperfused myocardial cells［J］.Brit J Pharmacol，2001，7（9）：132－136.

［11］張 鈞，許豪文.運(yùn)動對細(xì)胞凋亡的影響（綜述）［J］.體育學(xué)刊，2002，9（6）：45－48.

［12］楊連君，司曉輝，王文亮.凋亡相關(guān)蛋白Bax在肝細(xì)胞癌的表達(dá)及其意義［J］.診斷病理學(xué)雜志，2001，8（5）：282－284.

Effects of acute exercise to exhaustion on BcL－2，Bax gene of rat，sheart after supplyment of astragalus polysaccharide

MA Lanjun1，TIAN Zhenjun2
（1.Department of Physical Education，Xian University of Architecture ＆ Technology，Xian 710055；2.College of Physical Education of Sport，Shaanxi Normal University，Xian 710062）

To study the supplementary astragalus polysaccharide（APS）to exhaustion movement rats myocardial cell apoptosis，observe the influence of myocardial cell apoptosis BcL－2，the regulation of gene Bax changes，explore astragalus polysaccharide（APS）to exhaustion movement rats airframe of protection.By establishing high intensity exhaustion movement model of rats，the selection of adult health male SD rats 24 only randomly divided into quiet in the exercise group and control group，sports dosing group，the exercise group and exercise dosing groups according to training model sixweek endurance training，last training once exhaustion movement，exhaustion after motion myocardial organize and sample processing.Detection rats myocardial MDA content，using gap end labeling（TUNEL law）and the method of immunohis to chemistry methods were used by rats myocardial cell apoptosis I，ndex（AI）and BcL－2，Bax protein expression changes.In the exercise group MDA content，AI and BcL－2，Bax protein expression levels were significantly higher in quiet in control group（P ＜ 0.05）.Group compared with sports exercise dosing group MDA content，AI and Bax protein expression level decreased，and BcL－2protein expression levels rose significantly（P＜0.05）.Astragalus polysaccharide（APS）can restrain the movement exhaustion rats myocardial cell apoptosis，this function may reduce oxidatie stress，raised with BcL－2and cut Bax protein expression level concerned.

astragalus polysaccharide；exhaustion exercise；myocardial；apoptosis；BcL－2protein；Bax protein

Q956

A

1000－1190（2012）02－0214－04

2011－10－28.

國家科技部主任基金項(xiàng)目（31040045）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31040045）.

＊E－mail：mlj8398＠sohu.com.