富含高豐度蛋白的人參果實雙向電泳圖譜的建立

馬朋濤，孫立偉，麻 銳，雷秀娟，陳雪楠，祁 超＊

（1.華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430079；2.北華大學(xué) 生命科學(xué)中心，吉林 吉林 132013；3.長春中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，長春 130117；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 吉林 132109）

富含高豐度蛋白的人參果實雙向電泳圖譜的建立

馬朋濤1，孫立偉2＊，麻 銳3，雷秀娟4，陳雪楠2，祁 超1＊

（1.華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430079；2.北華大學(xué) 生命科學(xué)中心，吉林 吉林 132013；3.長春中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，長春 130117；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 吉林 132109）

通過常規(guī)的TCA－丙酮沉淀法和丙酮沉淀法對人參果實蛋白的提取效果，確立了丙酮沉淀法更適合人參果實蛋白的提取.為進一步改善其2－DE分離效果，對丙酮沉淀法提取的總蛋白用Tris－飽和酚提純，在其2－DE圖譜效果有所改善的基礎(chǔ)上，又在Tris－飽和酚中加入等體積的氯仿／異戊醇（24∶1）對丙酮沉淀法提取的總蛋白進行再次提純，最終得到質(zhì)量較高的2－DE圖譜，其高、低豐度蛋白都得到了較好的分離.

人參果實；蛋白提?。浑p向電泳；高豐度蛋白；低豐度蛋白

人參果實為名貴中藥人參的成熟果實.研究發(fā)現(xiàn)，人參果實中總皂苷的含量是人參根部的4倍左右，尤其皂苷Re的含量遠(yuǎn)高于人參根部［1-2］，所以人參果實除具有與人參根部相似的藥理學(xué)效用外［3-4］，其在降血糖方面的效果明顯優(yōu)于人參根部［5-7］.然而人參果實作為一種極具藥用潛質(zhì)的中藥材，長期以來人們對其研究卻只停留在皂苷組分的分離提取和利用方面，而對其中非皂苷類物質(zhì)及皂苷本身的合成規(guī)律、代謝途徑和調(diào)控機制的研究卻很少［8-12］.蛋白質(zhì)作為參與生命活動規(guī)律調(diào)節(jié)的酶的主要形式，是各種因素綜合作用于基因的最終表達(dá)結(jié)果，它們直接參與人參果實中皂苷等次級代謝產(chǎn)物的合成和代謝的調(diào)控過程，所以從蛋白質(zhì)角度可對人參果實藥效成分的合成代謝規(guī)律及其功效作用機制進行直接有效的研究.

作為一種分離、鑒定和分析不同組織在特定條件下蛋白表達(dá)情況的技術(shù)——蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可對人參果實蛋白進行高通量的分析和研究［13-14］.然而，高質(zhì)量、高重復(fù)率雙向電泳（2－DE）圖譜的獲得是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前提和關(guān)鍵.除了人參果實中含有的大量次級代謝產(chǎn)物會干擾高質(zhì)量2－DE圖譜的獲得外［15-17］，作者在對人參果實的研究中還發(fā)現(xiàn)，人參果實含有一些豐度極高的蛋白，極大地影響了高、低豐度蛋白的分離效果，尤其在目前對人參果實蛋白研究尚處于初始階段的情況下，高豐度蛋白的性質(zhì)尚不了解，這些都給人參果實2－DE圖譜的獲得帶了很大困難，嚴(yán)重阻礙了人參果實蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展［18-20］.

基于以上問題，試圖通過分析手段對高、低豐度蛋白進行同時分離，以尋求最好的高、低豐度蛋白的平衡分離效果.本文比較了幾種蛋白提取流程的2－DE分離效果，層層遞進，以確定每次方法改進所帶來的提取效果的變化，最終確定了人參果實蛋白的最佳提取方案，得到了較為理想的2－DE圖譜：在將高豐度蛋白進行有效分離的同時，還大大加強了低豐度蛋白的分離效果，為人參果實的蛋白質(zhì)組學(xué)分析打下基礎(chǔ)，同時也為同類含高豐度蛋白的果實類組織的2－DE分離提供方法學(xué)參考.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮成熟人參果實購與吉林省撫松縣.購回后，立即加入液氮研磨，待成粉末后，放于－80℃冰箱凍存待用.

1.2 儀器與試劑

2－DE系統(tǒng)和固化IPG線性干膠條：購自GE公司.聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）電泳儀：購自Bio－Rad公司.提取蛋白所需有機試劑均購自Amresco公司.乙醇、乙酸、丙酮等無機試劑均購自天津光夏精細(xì)化工研究所.

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白提取方法

（1）TCA－丙酮沉淀法 取0.25g液氮研磨的人參果實粉末加于2mL潔凈EP管，加入1.75mL預(yù)冷的含10%（m／v）TCA 和 0.07%（v／v）β－巰基乙醇的丙酮，漩渦震蕩均勻后放入－20℃冰箱靜置2h.15 000r／min、4℃條件下離心15min，棄上清，沉淀用100%丙酮洗滌3遍，每次在－20℃冰箱靜置1h，15 000r／min、4℃條件下離心15min棄上清，沉淀在放置在4℃待丙酮揮發(fā)干凈.加入0.5mL裂解液（7mol／L尿素，2mol／L硫脲，2%CHAPS，20mol／L DTT，1%（v／v）PMSF，1%（v／v）蛋白酶抑制劑），漩渦震蕩混勻，冰浴條件下200W 超聲35min，15 000r／min、4℃條件下離心15min，取上清.

（2）丙酮沉淀法 參照（1）方法，除去10%的TCA進行提取.

（3）Tris－飽和酚抽提 取上述（2）中提取蛋白溶液，加入等體積的Tris－飽和酚，并用30mol／L Tris溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，震 蕩 30mol／L，15 000r／min，4℃離心15min，取中下層，加入5倍體積的含10%（m／v）乙酸銨的甲醇溶液，－20℃靜置過夜.15 000r／min，4℃離心15min，棄上清.最后分別用含10%（m／v）乙酸銨的甲醇溶液和丙酮洗滌沉淀兩遍，將沉淀在4℃下晾干，用適量再水化液（5mol／L 尿素，2mol／L 硫脲，4%（m／v）CHAPS，2%（m／v）黃基三甲基胺乙內(nèi)脂3－10）溶解沉淀.

（4）Tris－飽和酚－氯仿／異戊醇抽提 取上述（2）中提取蛋白溶液，加入等體積的Tris－飽和酚和－氯仿／異戊醇（24∶1）混合溶液（1∶1），并用30mmol／L Tris 溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，震蕩30min，15 000r／min，4℃離心15min，取中下層，加入5倍體積的含10%（m／v）乙酸銨的甲醇溶液，－20℃靜置過夜.15 000r／min，4℃離心15min，棄上清.最后分別用含10%（m／v）乙酸銨的甲醇溶液和丙酮洗滌沉淀2遍，將沉淀在4℃下晾干，用適量再水化液（5mol／L尿素，2mol／L硫脲，4%CHAPS，2%（m／v）黃基三甲基胺乙內(nèi)脂3－10）溶解沉淀.

1.3.2 蛋白含量測定 蛋白溶液含量測定采用Bradford法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制蛋白濃度和OD值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測蛋白溶液的蛋白濃度.

1.3.3 SDS－PAGE根據(jù)測得的蛋白濃度，取30μg蛋白加入等體積的上樣緩沖液0.2%（w／v）溴酚 藍(lán)、20%（v／v）甘油、4%（w／v）SDS、0.5mol／LpH8.0Tris－HCl、0.3%（w／v）DTT 進行12.5%的SDS－PAGE，電泳參數(shù)設(shè)置為：濃縮膠電流10mA，分離膠電流為20mA，電泳2h.

1.3.4 等點聚焦電泳（IEF）取1.5mg蛋白溶液，加入18μL D2Buffer（20mmol／L DTT，5mmol／L磷酸三氯乙酯，0.5%IPG buffer（pH3～10），0.3%IPG buffer（pH4～7））及適量再水化液至終體積450μL.采用24cm，pH3～10線性固化IPG干膠條進行IEF.參數(shù)設(shè)置如表1所示.

表1 IEF過程參數(shù)設(shè)置Tab.1 Preferences of IEF progress

1.3.5 二向電泳（2D－PAGE） IEF結(jié)束后，膠條分別用含1.0%（m／v）DDT和2.5%IAA 的平衡緩沖液（50mmol／L Tris－HCl，pH8.8、6mol／L U－rea、30%（v／v）甘油、2%SDS、0.002%（w／v）溴酚藍(lán)儲存液）平衡15min.然后膠條進行12.5%的SDS－PAGE，參數(shù)設(shè)置為：轉(zhuǎn)移階段功率為2.5W／膠條，電泳階段功率為15W／膠條，電泳時間為6h.

1.3.6 凝膠染色與圖像掃描 電泳結(jié)束后用凝膠染色儀進行凝膠的染色和脫色處理.待凝膠背景清晰后用Image scanner掃描儀進行圖象掃描和分析.掃描參數(shù)設(shè)置為：256階灰度、600dpi分辨率，圖像保存為TIFF格式.掃描后的圖像用Image Master 2DPlatinum Software Version 6.0（GE Healthcare）結(jié)合手動進行蛋白點的檢測、匹配、數(shù)據(jù)分析和輸出等.

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS－PAGE圖譜的比較

各種蛋白提取方法所得的人參果實SDSPAGE電泳圖譜如圖1所示.

圖1 人參果實4種蛋白提取方法的SDS－PAGE圖譜Fig.1 SDS－PAGE（12.5%）pattern of ginseng fruit protein extrated by four methods

由圖1可以看出，幾種蛋白提取方法提取的蛋白一維條帶在20 000，25 000附近均含有2條豐度極高的蛋白條帶，經(jīng)Image Master 2DPlatinum Software Version 6.0（GE Healthcare）分析可知，其條帶總灰度可達(dá)全部條帶灰度的90%以上.另外在15 000、35 000、5 000附近有4條豐度相對較高的蛋白條帶，而在其他位置蛋白條帶豐度極低，這種蛋白條帶的分布將使得高豐度蛋白在某些區(qū)域過于集中而無法有效分離，同時低豐度蛋白濃度因此而所占比例更小，在更為廣泛的2－DE圖譜區(qū)域范圍內(nèi)會由于濃度過低而無法檢測到.比較幾種提取方法，可以發(fā)現(xiàn)，丙酮沉淀法、TCA－丙酮沉淀法所得的一維條帶高豐度蛋白比例尤其較高，低豐度蛋白區(qū)域幾乎沒有條帶，但丙酮沉淀法的分離效果要好于TCA－丙酮沉淀法.對丙酮沉淀提取法提取的蛋白溶液用Tris－飽和酚進一步提取，低豐度蛋白條帶豐度和數(shù)目有明顯改進.在此基礎(chǔ)上，在Tris－飽和酚中加入等體積的氯仿／異戊醇（24∶1）對丙酮沉淀提取法提取的蛋白進行再次提純，低豐度蛋白條帶的數(shù)量和豐度進一步得到了提高.但幾種蛋白提取流程對2－DE圖譜分離效果的改進僅通過一維條帶無法完全確定，尤其幾種蛋白提取流程所得的高豐度蛋白條帶并無明顯變化.這還需對其進行2－DE分離，以確定各提取流程對人參果實全蛋白的2－DE分離效果.

2.2 2－DE圖譜的比較

各種蛋白提取方法所得的人參果實2－DE圖譜如圖2所示.

圖2 人參果實4種不同蛋白提取方法的二維圖譜（24cm，pH3～10）Fig.2 2－DE pattern of four protein extraction methods of ginseng fruit（24cm，pH3～10）

由圖2可以看出，丙酮提取法、TCA－丙酮提取法得到的2－DE圖譜只有幾個高豐蛋白點和少量的低豐度蛋白點，且高豐度蛋白點幾乎沒有分開，呈連成一片趨勢，這可能也會掩蓋周圍的低豐度蛋白點，也可能造成其他低豐度蛋白點所占比例過低，而無法在2－DE圖譜上被檢測到.但相比較而言，丙酮提取法的蛋白分離效果要稍好于TCA－丙酮沉淀法，這也印證了一維條帶中二者效果的比較.

選定丙酮提取法提取的蛋白溶液用Tris－飽和酚進行提純，通過Tris－飽和酚的強烈變性效果加強低豐度蛋白的變性溶解，其低豐度蛋白點明顯增多，尤其在偏低分子量區(qū)域低豐度蛋白點得到明顯改善.但中高分子量區(qū)域（20 000～50 000）低豐度蛋白點仍由于豐度過低仍然顯得模糊不清分辨率不高，且高豐度蛋白仍然沒有完全分離，其附近的低豐度蛋白也可能由此而被掩蓋.在此基礎(chǔ)上，在Tris－飽和酚中加入等體積的氯仿／異戊醇（24∶1），以加強一些脂溶性雜質(zhì)的去除效果，同時還有Tris－飽和酚對蛋白的強烈變性作用，使得中高分子量區(qū)域的低豐度蛋白的分離也得到了進一步加強，且高豐度蛋白也得到了較好的分離，其附近也分離出一些新的低豐度蛋白點.

圖3 人參果實不同提取方法分區(qū)域雙向電泳圖譜比較Fig.3 Comparion of different area of 2－DE pattern by different protein extraction methods

對4種蛋白提取方法的關(guān)鍵區(qū)域進行截圖方法處理，得到了4個蛋白分離效果明顯改進的區(qū)域（圖3所示），在選定的A、B、C、D等4個區(qū)域中，可以看到，應(yīng)用Tris－飽和酚－氯仿／異戊醇提取法得到的2－DE圖譜與其他3種蛋白提取方法相比，很多蛋白點的分離效果得到了明顯改善或獲得了新的蛋白點，比如A4區(qū)域中10個高豐度蛋白點基本得到了很好的分離，且在這10個高豐度蛋白點附近的33個低豐度蛋白點（如A4中箭頭所示）的分離效果得到了明顯改善.而在B、C、D等3個區(qū)域中也分別有33個、37個、34個蛋白點（如B4、C4、D4中箭頭所示）的分離效果也明顯提高.這說明，采用Tris－飽和酚－氯仿／異戊醇提取法可對人參果實蛋白質(zhì)的各種雜質(zhì)進行比較完全的去除，從而改善了高豐度蛋白的分離效果，并且加強了低豐度蛋白點的分辨率，還得到了一批新的低豐度蛋白點.

高豐度蛋白和低豐度蛋白的分離一直是2－DE過程中的一大難題，尤其植物組織高度的特異性使得不同植物組織在特定的環(huán)境中呈現(xiàn)出不同的蛋白表達(dá)特點.很多植物組織都會由于特定環(huán)境的作用大量表達(dá)某些蛋白，然而這種特定環(huán)境下的蛋白表達(dá)模式嚴(yán)重阻礙了該組織蛋白質(zhì)組學(xué)的研究.目前文獻中報道了很多去除高豐度蛋白的方案來加強低豐度蛋白的相對濃度，以期實現(xiàn)低豐度蛋白較好的分離效果.但這些方案一般都是在對高豐度蛋白性質(zhì)充分了解的基礎(chǔ)上，針對高豐度蛋白特有的性質(zhì)再利用親和層析、沉淀和超濾離心以及等電點捕獲法等物理學(xué)、化學(xué)技術(shù)，去除同一類別且與低豐度蛋白性質(zhì)不同的一些高豐度蛋白［20-23］.但對于人參果實來說，目前對其蛋白質(zhì)的研究尚處于初始階段，使得上述去除高豐度蛋白的方案無法應(yīng)用于人參果實蛋白的處理.這是因為一方面目前還不了解其高豐度蛋白的相關(guān)特性，另一方面需要防止一些特性與高豐度蛋白相似的低豐度蛋白同時被去除.所以我們通過對蛋白提取流程進行逐步改進，以確定不同提取參數(shù)對高、低豐度蛋白統(tǒng)籌去除效果的變化，最終建立了最適合人參果實2－DE分析的蛋白提取流程.

3 結(jié)論

本文通過比較不同分析方法對人參果實2－DE圖譜的改進效果，對高、低豐度蛋白進行了較好的平衡分離，獲得了高質(zhì)量的人參果實2－DE圖譜.這為人參果實下一步的蛋白質(zhì)組學(xué)研究打下了堅實基礎(chǔ)，同時對類似的含有高豐度蛋白的組織具有很大的借鑒意義.

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Establishment of 2－DE pattern of ginseng fruit，a tissue containing high levels of high abundant proteins

MA Pengtao1，SUN Liwei2，MA Rui3，LEI Xiujuan4，CHEN Xuenan2，QI Chao1
（1.College of Life Science，Huazhong Normal University，Wuhan 430070；2.Life Science Research Center，Beihua University，Jilin，Jilin 132013；3.College of Pharmacy，Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130023；4.Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Jilin，Jilin 132109）

In this paper，TCA－acetone precipitation method and acetone precipitation method were firstly compared and the latter was fixed to better suit the separation for the proteins of ginseng fruit.Then，the proteins extracted by the acetone precipitation method were optimized by the Tris－saturated phenol，which results in better improvement of the two－dimensional electrophoresis（2－DE）pattern.On this basis，equivoluminal chloroform／isoamyl alcohol（24∶1）was added to the Tris－saturated phenol to optimize the proteins extracted by the acetone precipitation method，and high－quality 2－DE was establish ultimately，which contains better separated spots of both higher and lower abundant proteins.It will lay the foundation for the proteomic analysis of ginseng fruit，and also provide a reference for 2－DE separation of proteins from similar tissues

ginseng fruit；protein extraction；2－DE；high abundant protein；low abundant protein

Q946

A

1000－1190（2012）02－0198－06

2011－09－20.

國家科技支撐計劃項目（2007BAI38B02）；國家自然科學(xué)基金項目（nsfc81041091）.

＊通訊聯(lián)系人.E－mail：sunliwei1970＠yahoo.com；E－mail：qichao＠m(xù)ail.ccnu.edu.cn.