海綿中提取的異臭椿萜類化合物作用靶標(biāo)的識別

田 然 劉振明, 金宏威 張亮仁 林文翰

(北京大學(xué)藥學(xué)院,天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室,北京100191)

海綿中提取的異臭椿萜類化合物作用靶標(biāo)的識別

田 然§劉振明§,*金宏威 張亮仁 林文翰*

(北京大學(xué)藥學(xué)院,天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室,北京100191)

采取了包括化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性學(xué)習(xí)、靶標(biāo)聚類分析以及反向?qū)雍Y選等多種方法在內(nèi)的綜合性策略,嘗試對中國南海海綿中提取得到的異臭椿萜類化合物進行生物學(xué)活性和作用靶標(biāo)的預(yù)測.結(jié)果表明:這類化合物具有治療心肌缺血和抗腫瘤的潛在生物學(xué)活性;表皮細(xì)胞生長因子受體(EGFR),焦點(局部)粘著斑激酶(FAK),胰島素樣生長因子1受體(IGF1-R),c-Src激酶以及血管表皮生長因子受體2(VEGF-R2)是這類化合物可能的作用靶標(biāo).IC50值從0.41 g·m-3(0.41 μg·mL-1)到9.8 g·m-3(9.8 μg·mL-1)不等.活性數(shù)據(jù)顯示這些海綿提取的海洋天然產(chǎn)物可作為先導(dǎo)化合物,通過進一步的優(yōu)化獲得新的藥物.同時還討論了化合物與預(yù)測靶標(biāo)的結(jié)合模式,結(jié)果顯示四個化合物都與相應(yīng)的受體有較好的結(jié)合.

海洋天然產(chǎn)物;異臭椿三萜類化合物;PASS程序;反向虛擬篩選;靶標(biāo)識別;抗腫瘤活性

1 引言

從遠(yuǎn)古時代起,人類就意識到可以從自然界中尋找藥物.直到現(xiàn)在,市場銷售最好的藥物中,約有三分之一都是天然產(chǎn)物,或者是以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)而改造得到的.1,2現(xiàn)階段,我們用于新藥來源的天然產(chǎn)物通常都是來自于陸生生物.但是,伴隨著陸生物種研究的深入和枯竭,新藥的天然來源將會變得越來越有限.

海洋占據(jù)了地球超過70%的表面積,大約存在著5億種的不同生物,約為全球生物物種的一半,擁有的生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過想象.海洋環(huán)境具有高鹽、高壓、缺氧和避光的特性,從而導(dǎo)致海洋生物在生活習(xí)性、次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑及酶催化反應(yīng)機制上與陸生生物完全不同,可以提供全新的化學(xué)結(jié)構(gòu).3-5目前,尋找高效的、具有特異性的藥物用于人類疾病的治療已經(jīng)成為一個重要的趨勢.海洋生物蘊藏著大量天然產(chǎn)物和新型化學(xué)實體,越來越受到研究者的關(guān)注.6-9

目前,阻止海洋天然產(chǎn)物成為治療藥物的重要原因是它們本身的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性以及作用靶標(biāo)與藥理學(xué)機制不明確;因此研究者無法依據(jù)靶標(biāo)對它們及其衍生物進行結(jié)構(gòu)設(shè)計和化學(xué)修飾改造.由于進行蛋白質(zhì)和基因水平上的生物活性篩選范圍太廣,周期較長,耗費資金多,目前大多數(shù)的海洋天然產(chǎn)物所測定的初步生物活性是基于細(xì)胞水平的,因此無法知道其在生物體內(nèi)作用的具體靶點.10,11雖然在此基礎(chǔ)上可以將具有較好生物活性的海洋天然產(chǎn)物作為先導(dǎo)化合物,通過合成和改變其不同取代基團來研究其結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系,從而找出活性更好的結(jié)構(gòu)類型.但是由于海洋天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)獨特,其合成和改造一般較難完成.12-14

本研究建立了一種基于化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性學(xué)習(xí)、聚類分析以及反向?qū)诱野械榷喾N方法在內(nèi)的綜合性生物活性預(yù)測策略,對從中國南海海綿中提取得到的四個全新異臭椿萜類化合物(如圖1所示)進行生物學(xué)活性和作用靶標(biāo)的預(yù)測.這些化合物代表了典型的異臭椿萜類化合物的結(jié)構(gòu)特征.

2 方法和材料

本課題研究所用的異臭椿萜類化合物采自海南島三亞附近海域的海綿(Jaspis sp.)和采自中國南海海域黃海綿(Rhabdastrella aff.Distincta)中提取分離所得,15,16具體化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示.

針對所選取化合物的靶標(biāo)搜尋過程與策略如圖2所示.具體來講,首先選擇所研究異臭椿萜類化合物的二維結(jié)構(gòu)作為提問分子,通過搜索PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances)系統(tǒng)所提供的SAR(Structure-Activities Relationship)訓(xùn)練集合,從分子骨架片段相似性出發(fā)進行初步生物學(xué)活性的預(yù)測;通過對所得到生物活性的聚類分析,發(fā)現(xiàn)這些化合物的潛在生物活性.17,18進一步的研究工作采用反向虛擬找靶方法,對接實驗室建立的人類疾病相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)信息數(shù)據(jù)庫(HDRP-SID, unpublished work),對這些化合物的潛在靶標(biāo)進行精確預(yù)測,并通過酶活性試驗進行證實.最后,通過對這些化合物與靶標(biāo)激酶的結(jié)合模式研究進一步闡述相互作用的空間結(jié)構(gòu)特征,為這類異臭椿萜類化合物的進一步修飾和研究提供指導(dǎo)和依據(jù).

2.1 化合物結(jié)構(gòu)的構(gòu)建

所有異臭椿萜類化合物的二維結(jié)構(gòu)是在Chem-Draw Ultra 8.0軟件(http://www.chemcad.com)19中構(gòu)建的,所有結(jié)構(gòu)皆以MOL文件格式儲存以備下一步使用.

圖1 從Jaspis sp.和Rhabdastrella aff.Distincta中提取的4種異臭椿萜類化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of four isomalabaricane triterpenoids extracted from Jaspis sp.and Rhabdastrella aff.Distincta

異臭椿萜類化合物的三維結(jié)構(gòu)是在SYBYL 6.91軟件包20中構(gòu)建的.在優(yōu)化過程中,采用Tripos力場,加載Gasteiger電荷,先以共軛梯度法優(yōu)化1000步,再以最陡下降法優(yōu)化至收斂,收斂標(biāo)準(zhǔn)為能量梯度(0.042 kJ·mol-1·nm-1).所得結(jié)構(gòu)均以MOL2文件格式存儲以備下一步使用.

2.2 基于小分子化合物結(jié)構(gòu)的生物活性預(yù)測

PASS系統(tǒng)是基于小分子活性片段進行活性預(yù)測的在線服務(wù)系統(tǒng),21可以為類藥化合物預(yù)測潛在的生物活性.該系統(tǒng)囊括了35000個以上的具有不同生物活性的非同類化合物以及500種不同類型生物活性,包括藥理學(xué)作用、作用機理、致突變性、致癌性、致畸性和胚胎毒性等,并由這些化合物構(gòu)成了龐大的訓(xùn)練集數(shù)據(jù)庫.該系統(tǒng)對于化合物生物活性的預(yù)測正是基于對訓(xùn)練集的結(jié)構(gòu)-生物活性關(guān)系的分析得到的結(jié)果.

將已構(gòu)建好的異臭椿萜類化合物的二維MOL格式結(jié)構(gòu)輸入PASS的SAR訓(xùn)練集數(shù)據(jù)庫中.經(jīng)過庫搜索和結(jié)構(gòu)匹配,選取預(yù)測準(zhǔn)確性Pa＞0.7的部分作為所研究化合物可能具有的生物活性,并作為進一步研究和分析的依據(jù).計算過程中的所有參數(shù)均采用系統(tǒng)默認(rèn)設(shè)置.

PASS的基本元素包括生物活性表述、化學(xué)結(jié)構(gòu)描述、化合物訓(xùn)練集、訓(xùn)練程序和預(yù)測程序.訓(xùn)練程序生成各類型生物活性的結(jié)構(gòu)-生物活性關(guān)系,當(dāng)輸入提問化合物二維結(jié)構(gòu)時,程序會自動將該結(jié)構(gòu)以MNA(Multilevel Neighborhoods of Atoms)描述符方式表示,然后預(yù)測程序?qū)⑻釂柣衔锱c訓(xùn)練集相匹配,從而得到提問化合物可能的生物活性.

2.3 基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)搜尋的反向分子對接

三維結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)搜尋方法需要具備三個必要元素:靶標(biāo)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫、反向分子對接程序以及快速可靠的打分函數(shù).

2.3.1 靶標(biāo)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫

選取了本實驗室開發(fā)的人類疾病相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)信息數(shù)據(jù)庫HDRP-SID作為異臭椿萜類化合物的靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫篩選對象,通過對生物活性預(yù)測所得到的疾病相關(guān)靶標(biāo)的反向?qū)泳_確證化合物在生物體內(nèi)的潛在作用靶點.

圖2 針對異臭椿萜類化合物進行作用靶標(biāo)搜尋的流程圖Fig.2 Flow chart for target identification and biological testing of isomalabaricane terpenes extracted from sponges of the South China Sea

人類疾病相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)信息數(shù)據(jù)庫收錄了2266套蛋白三維結(jié)構(gòu)與結(jié)合位點數(shù)據(jù),包括約600個藥物靶點以及超過1700個與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì),與人類血液循環(huán)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、遺傳紊亂、腫瘤、細(xì)菌感染、傳染病及寄生疾病等九大類疾病相關(guān).對于同一種蛋白,PDB數(shù)據(jù)庫(http:// www.rcsb.org)中往往有許多來源不同、分辨率不同、結(jié)構(gòu)狀態(tài)不同的三維結(jié)構(gòu),該數(shù)據(jù)庫盡量收集了PDB中所有的典型結(jié)構(gòu).由于結(jié)合不同抑制劑時,蛋白的三維結(jié)構(gòu)尤其是結(jié)合口袋處的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化.對于此種情況,數(shù)據(jù)庫收錄了至少兩套符合以上挑選條件的結(jié)合了不同抑制劑的蛋白結(jié)構(gòu),作為這些蛋白的冗余結(jié)構(gòu),以保證在篩選時可以給予這些重要蛋白充分的考慮.

2.3.2 分子對接程序

基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的反向靶標(biāo)搜尋策略是建立在DOCK 4.06程序22之上的一種改進.雖然DOCK 4.06程序本身的計算精確度不如已知的其他很多分子對接程序,23-27但它所具有的計算速度快,通過簡單修飾就可以實現(xiàn)配體庫對靶標(biāo)庫的對接策略等優(yōu)點使得它可以很方便地被用于配體的反向靶標(biāo)庫對接和生物活性的預(yù)測研究中.

對靶標(biāo)三維結(jié)構(gòu)的前處理及分子對接過程中參數(shù)設(shè)置如下:除去原靶標(biāo)晶體結(jié)構(gòu)中的水分子、復(fù)合物配體分子及輔助因子,保留金屬離子,以PDB文件格式保存.在前面操作的基礎(chǔ)上添加全氫原子,并在AMBER7 FF99力場上加載電荷,以MOL2文件格式保存.采用SPHGEN程序,選取原靶標(biāo)結(jié)構(gòu)中的復(fù)合物配體或已證實的關(guān)鍵氨基酸殘基周圍0.6 nm范圍內(nèi)的氨基酸殘基作為每個靶標(biāo)的活性位點并生成相應(yīng)的負(fù)像.

進行分子對接時,atom_model參數(shù)設(shè)置為united atom models,每個靶標(biāo)與每個異臭椿萜類化合物最后保存的結(jié)合模式個數(shù)設(shè)置為1,即只保存打分最高、認(rèn)為結(jié)合最好最合理的模式.其它參數(shù)均采用缺省值.通過perl腳本程序?qū)崿F(xiàn)了DOCK 4.06程序?qū)Χ嗟鞍捉Y(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)的調(diào)用,所得的反向虛擬篩選結(jié)果依照能量打分由低到高的順序排列,保留能量低于-104.6 kJ·mol-1的靶標(biāo)作進一步分析.將最后得到的結(jié)合能力評價結(jié)果按照受體結(jié)合口袋與配體的分子大小進行權(quán)重處理后進行輸出,從而實現(xiàn)了多重對接策略下的評價結(jié)果的可比性與真實性.

2.3.3 打分函數(shù)

這里選取DOCK4.06程序所提供的能量打分作為一次打分函數(shù),并按照蛋白靶標(biāo)的結(jié)合口袋大小和靜電的數(shù)目對所得的打分結(jié)果進行權(quán)重修正和二次排名.

2.4 酶抑制實驗

根據(jù)反向靶標(biāo)搜尋結(jié)果,對所研究的異臭椿萜類化合物與預(yù)測所得到的表皮細(xì)胞生長因子受體,焦點(局部)粘著斑激酶,胰島素樣生長因子1受體, c-Src激酶以及血管表皮生長因子受體2等部分蛋白激酶的抑制活性進行了酶學(xué)研究和測定.

所有蛋白激酶的活性均通過測定轉(zhuǎn)移到激酶底物上的[γ-33P]-ATP的[33P]放射活度來檢測,所有操作均在96孔板中進行.反應(yīng)混合液包含:(1)2×10-8m-3(20 μL)酶反應(yīng)緩沖液,包括60 mmol·L-1的HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic)-NaOH(pH=7.5),3 mmol·L-1MgCl2,3 mmol·L-1的MnCl2,3 μmol·L-1的Na3VO4,1.2 mmol·L-1DTT (dithiothreitol),50 g·m-3(50 μg·mL-1)PEG20000,1 μmol·L-1[γ-33P]-ATP(adenosine triphosphate)(PerkinElmer,Inc.Waltham,MA 02451,USA.每孔約5× 105min-1);(2)5×10-9m-3(5 μL)ATP水溶液;(3)5× 10-9m-3(5 μL)測試化合物的DMSO(dimethylsulfoxide)溶液;(4)1×10-8m-3(10 μL)多肽底物Poly(Glu, Tyr)4:1(Cell Signaling Technology,Inc.2 Trask Lane, Danvers,MA 01923);(5)1×10-8m-3(10 μL)純凈的重組蛋白激酶(Bio-WORLD,Dublin,USA),酶反應(yīng)液總體積為5×10-8m-3(50 μL).

加入1×10-8m-3(10 μL)重組蛋白激酶啟動酶反應(yīng),30°C水浴孵育80 min.加入5×10-8m-3(50 μL)的2%(V/V)H3PO4溶液結(jié)束反應(yīng),用2×10-7m-3(200 μL)的0.009 g·mL-1NaCl溶液沖洗96孔板兩次,采用微量閃爍計數(shù)器測定其放射性,以所測放射性計數(shù)率來反映激酶活性.除了特殊說明外,所有試劑均為來源于Sigma-Aldrich北京公司的分析純試劑.

2.5 異臭椿萜類化合物與確證靶標(biāo)的結(jié)合模式分析

選用AutoDOCK 3.05程序,28,29對確證靶標(biāo)分子與異臭椿萜類化合物的結(jié)合模式進行分析研究.

對接過程所需要的受體三維結(jié)構(gòu)均來自PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫,包括EGF-R(PDB ID:1XKK),FAK (PDB ID:2ETM),IGF1-R(PDB ID:2OJ9),c-Src激酶(PDB ID:1NZL)和VEGF-R2(PDB ID:1Y6B).

將PDB結(jié)構(gòu)文件中的水分子、離子、配體小分子、輔助因子及多余的蛋白質(zhì)去除,僅保留與結(jié)合模式研究有關(guān)的蛋白質(zhì)單體結(jié)構(gòu),并修補各蛋白質(zhì)單體結(jié)構(gòu)中缺失的氨基酸殘基.

使用AutoDock Tools為受體和配體添加氫原子及電荷,并為受體分子添加溶劑化參數(shù).本研究課題中,受體分子加載的是Kollman電荷,配體分子添加的是Gasteiger電荷.對接過程中所做格點的范圍是以原PDB文件中復(fù)合物配體分子為中心,在x、y、z軸上分別延伸50個格點的范圍.對接采用的是GALS(Lamarckian Genetic Algorithm)算法,對每一個配體進行100次單獨的運算.對接構(gòu)象的聚類分析采用的RMSD值是0.1 nm.其余參數(shù)均采用默認(rèn)值.

3 結(jié)果與討論

3.1 基于PASS程序的生物活性實驗預(yù)測

所選取化合物基于配體結(jié)構(gòu)片段的生物活性預(yù)測結(jié)果如表1所示:Pa為具有對應(yīng)生物學(xué)活性的概率;Pi為非生物學(xué)活性的概率.由以上結(jié)果可以看出,由于是同一類型的化合物,且結(jié)構(gòu)差異不是特別大,PASS預(yù)測得到的結(jié)果也十分相近.尤其是1和3這一對化合物,是C13、C14間雙鍵的順反異構(gòu)體,異構(gòu)體彼此之間的預(yù)測結(jié)果是完全相同的.由于PASS程序考慮的只是小分子化合物的二維結(jié)構(gòu),而且是以MNA的方式將每個化合物拆分成描述符來表示,雙鍵的順反異構(gòu)體拆分的描述符是一致的,因此所得的預(yù)測結(jié)果也是完全相同的.這個結(jié)果一方面說明了PASS程序在光學(xué)異構(gòu)體活性預(yù)測方面的不足和缺陷,但另一方面也可以體現(xiàn)了預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可信性.

上述結(jié)果中引起我們注意的主要有兩點:

(1)所有化合物預(yù)測結(jié)果中都包含有抗腫瘤劑的生物活性;(2)含有內(nèi)酯環(huán)的化合物具有心肌缺血治療的生物活性.

第一點說明此類化合物極有可能具有抗腫瘤的生物活性,這方面通過文獻和抗腫瘤細(xì)胞活性實驗得到了證實.結(jié)果表明:(1)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)中的六元不飽和內(nèi)酯部分是最重要的影響因素,最典型的表現(xiàn)就是在抑制HL-60人白血病細(xì)胞增殖的試驗中,若無六元不飽和內(nèi)酯環(huán),其抗腫瘤活性會有很大程度的下降;(2)C-13/C-14烯雙鍵的構(gòu)型,C-13/C-14位為Z-式構(gòu)型樣品的活性要低于E-式構(gòu)型;(3)C-3位取代基中對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率大小依次為羥基＞羰基＞乙酰氧基,但是相對來說對抗腫瘤活性的影響不如以上兩種因素那么大.

針對第二點預(yù)測結(jié)果,我們最初懷疑內(nèi)酯環(huán)為這一類活性的關(guān)鍵官能團,所以又以內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)作為提問結(jié)構(gòu)進行PASS預(yù)測,但所得心肌缺血治療項的Pa值只有0.714.我們嘗試以圖3中所示a結(jié)構(gòu)作為提問結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,所得心肌缺血治療項的Pa高達0.988.我們以此結(jié)構(gòu)在MDL數(shù)據(jù)庫中進行搜索,期望可以找到與a結(jié)構(gòu)類似或含有此結(jié)構(gòu)的已知具有該生物活性的化合物,但結(jié)果并不理想.隨后,我們采用b結(jié)構(gòu)進行MDL數(shù)據(jù)庫搜索,得到如c所示的化合物,它具有抗心絞痛作用,從而說明異臭椿萜類化合物所包含的部分骨架片段可能具有心肌缺血治療作用.

3.2 基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)搜尋

PASS活性預(yù)測結(jié)果和細(xì)胞實驗表明,異臭椿萜類化合物對多種腫瘤細(xì)胞具有良好的抑制活性,備受科學(xué)家們的關(guān)注,有望成為一類新型、高效、低毒的抗腫瘤制劑.同時,異臭椿萜類化合物所包含的部分骨架片段可能具有心肌缺血治療作用的預(yù)測,使得找到并確定此類化合物的作用靶標(biāo)對于進一步的藥學(xué)研究和應(yīng)用具有重要意義.

表1 基于配體結(jié)構(gòu)片段的生物活性預(yù)測Table 1 Predicted results of biological activities based on substrate fragments

圖3 具有心肌缺血治療活性結(jié)構(gòu)片段的搜尋與預(yù)測Fig.3 Searching for the chemical fragment related to myocardial ischemia treatment

由于每個化合物的反向?qū)宇A(yù)測結(jié)果都比較多,靶標(biāo)數(shù)目往往超過100個.它們中間有些功能已明確,與多種疾病相關(guān),有些功能至今還是未知的.同時,在分子對接過程中還會存在不少假陽性的情況.基于以上兩點原因,為了提高結(jié)果的可信度和減少假陽性情況的發(fā)生概率,我們從初步篩選排名結(jié)果中再選擇出現(xiàn)頻率在兩次以上的靶標(biāo)作為最終結(jié)果如表2所示.從表2中可以看到:有些蛋白質(zhì)靶標(biāo)在四個化合物的篩選最終結(jié)果中都有出現(xiàn),有些靶標(biāo)出現(xiàn)在兩個化合物的篩選最終結(jié)果中,有些化合物雖然只出現(xiàn)在一個化合物的篩選最終結(jié)果中,但它在其它化合物的篩選初步結(jié)果中也曾出現(xiàn)了一次.

表2 基于三維結(jié)構(gòu)搜尋預(yù)測得到的蛋白靶標(biāo)列表Table 2 List of putative protein targets from reverse docking with HDRP-SID database

3.3 酶抑制實驗

由于異臭椿萜類化合物的樣品量限制,我們測定了所研究化合物對表皮細(xì)胞生長因子受體、焦點(局部)粘著斑激酶,胰島素樣生長因子1受體, c-Src激酶以及血管表皮生長因子受體2等部分蛋白激酶的生物活性.所有蛋白激酶的活性均通過測定轉(zhuǎn)移到激酶底物上的[γ-33P]-ATP的[33P]放射活度來檢測.活性測定結(jié)果如圖4所示.

從酶抑制實驗結(jié)果可以看出,各化合物確實可以與這些激酶相結(jié)合,抑制其酶活性,說明EGFR, FAK,IGF1-R,c-Src激酶和VEGF-R2是這幾個化合物甚至是異臭椿萜類化合物的潛在作用靶標(biāo).上述酶活性實驗結(jié)果表明,這些化合物對IGF1-R和c-Src激酶的抑制活性最好,對FAK相對較差;化合物2與其它三個相比活性稍弱;化合物1和3為C13、C14間雙鍵的順反異構(gòu)體,但它們對各激酶的抑制活性比較接近,區(qū)別并不明顯;化合物4雖然也不含有內(nèi)酯環(huán),但其對各激酶的抑制活性比2要好,與含有內(nèi)酯環(huán)的1、3活性非常接近.

3.4 結(jié)合模式分析

我們對所研究化合物與上述五個蛋白激酶的空間結(jié)合模式進行了分子識別研究,選取了EGF-R (PDB ID:1XKK),FAK(PDB ID:2ETM),IGF1-R (PDB ID:2OJ9),c-Src激酶(PDB ID:1NZL),VEGFR2(PDB ID:1Y6B)五個晶體結(jié)構(gòu)作為相互作用的研究對象.對接結(jié)果如圖5所示.

從圖5中可以看出,我們所研究的異臭椿萜類化合物均深埋于上述激酶的結(jié)合口袋中,大多數(shù)可以與激酶形成氫鍵.所有化合物以相似的結(jié)合模式與激酶相互作用,但由于C13、C14間雙鍵的構(gòu)象不同,相同構(gòu)象的化合物在激酶口袋中采取相同的延伸方向.我們還發(fā)現(xiàn),所研究激酶活性口袋的狹長孔道形狀正適合于上述異臭椿萜類化合物的長鏈結(jié)構(gòu).由于上述化合物中僅含有少量的極性基團,在疏水接觸與靶點激酶的相互作用中起關(guān)鍵作用.

圖4 四個異臭椿萜類化合物對EGFR、FAK、IGF1-R、c-Src、VEGF-R2生物活性(IC50)的抑制Fig.4 IC50values with the inhibition of EGFR,FAK, IGF1-R,c-Src,and VEGF-R2 by those four compounds

所研究的四個化合物以相似的模式與表皮生長因子受體EGFR相結(jié)合,C13、C14間雙鍵構(gòu)型相同的化合物延伸方向相同.化合物1、2、3皆可與鉸鏈區(qū)的Cys797上的N原子形成氫鍵.化合物1還可以與殘基Asp800上的O原子之間形成氫鍵.化合物4由于較其它化合物支鏈較長,僅能與Tyr998的酚羥基形成氫鍵.與FAK蛋白激酶的對接結(jié)果顯示,化合物1、2中A環(huán)的羰基可與激酶的Arg550上的胍基N原子和Ser568的羥基形成氫鍵.雖然其它兩個化合物由于構(gòu)象不同未能與FAK形成氫鍵,但它們可與此激酶以疏水作用緊密結(jié)合.

從圖5中我們可以清楚地看到:除化合物1以外,其它三個化合物都可與表皮血管生長因子受體VEGF-R2鉸鏈區(qū)Lys866的氨基N原子形成氫鍵.構(gòu)型相同的化合物在此激酶的結(jié)合口袋中采取相同的方向延伸.上述化合物與IGF1-R的相互作用模式提供了相對更多的信息.化合物1、2都可與酶上Ser979的羥基O和氨基N、Phe980氨基N原子形成氫鍵;化合物3可與激酶Phe980氨基N和Gly1055氨基N原子形成氫鍵;化合物4不僅可以與激酶Ser979的羥基O形成氫鍵,而且可以與Phe980、Lys1003和Gly1055的氨基N原子形成牢固的氫鍵.我們猜測IGF1-R與所研究化合物相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基為Ser979及Phe980.

化合物1和2都可以與c-Src激酶的Lys309的氨基N原子形成氫鍵;化合物1和3都可以與激酶Arg261的胍基N原子形成氫鍵;所有化合物都可與激酶Thr285的羥基O原子形成氫鍵;而化合物4又可與Arg281的胍基N原子形成氫鍵.

圖5 異臭椿萜類化合物與EGFR,FAK,VEGF-R2,IGF1-R以及c-Src激酶的相互作用模式Fig.5 Binding of isomalabaricane terpenes with potential targets EGFR,FAK,VEGF-R2,IGF1-R and c-Src kinase The symbols a,b,c,d in each figure represent compound 1,2,3,4,respectively.

4 結(jié)論

本研究工作顯示,異臭椿萜類化合物可能具有抗腫瘤的生物活性,而且其中含有內(nèi)酯環(huán)的化合物可能具有心肌缺血治療作用.

基于分子對接的反向虛擬篩選方法,預(yù)測得到了異臭椿萜類可能的作用靶標(biāo),并用酶活性試驗驗證了此類化合物確實可以抑制表皮細(xì)胞生長因子受體、焦點(局部)粘著斑激酶、胰島素樣生長因子1受體、c-Src激酶以及血管表皮生長因子受體2的酶活性,而且進一步研究和推測了它們的結(jié)合模式.這幾種蛋白激酶均與腫瘤生成相關(guān),已經(jīng)或可能成為抗腫瘤靶標(biāo),與前面PASS預(yù)測結(jié)果相互驗證,這不僅證明了以上兩種方法應(yīng)用于海洋天然產(chǎn)物的靶標(biāo)預(yù)測具有一定的可行性和準(zhǔn)確性,更為異臭椿萜類化合物的進一步研究提供了重要信息和理論基礎(chǔ).

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November 22,2010;Revised:February 17,2011;Published on Web:April 13,2011.

Target Identification of Isomalabaricane Terpenes Extracted from Sponges

TIAN Ran§LIU Zhen-Ming§,*JIN Hong-Wei ZHANG Liang-Ren LIN Wen-Han*
(State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs,School of Pharmaceutical Sciences,Peking University, Beijing 100191,P.R.China)

A strategy combining structure alignment and comparation,target cluster,and invert-docking screening were undertaken to detect the potential bioactivities of several isomalabaricane triterpenoids that were extracted from sponge.The prediction results revealed that the chemicals underwent myocardial ischemia treatment and had antineoplastic bioactivities.Enzymatic bioassays showed that epidermal growth factor receptor(EGFR),focal adhesion kinase(FAK),insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1-R),c-Src kinase,and vascular endothelial growth factor receptor 2(VEGF-R2)were potential targets for these compounds.They had IC50values ranging from 0.41 g·m-3(0.41 μg·mL-1)to 9.8 g·m-3(9.8 μg·mL-1),which is meaningful for the use of these marine natural products as leads for further modifications to new agents.Ligand-target binding mode with these compounds were undertaken and indicated that the four studied chemicals bound well with the targets.

Marine natural product;Isomalabaricane triterpenoid;Program ofPrediction ofActivity Spectra forSubstances;Reverse virtual screening;Target identification;Antineoplastic bioactivity

O641

*Corresponding authors.LIU Zhen-Ming,Email:zmliu@bjmu.edu.cn;Tel:+86-10-82805514.LIN Wen-Han,Email:whlin@bjmu.edu.cn;

Tel:+86-10-82806188.

§These authors contributed equally to this work.

The project was supported by the Major National Science and Technology Program-Key Drug Scheme Funds(2009ZX09501-002)and National Natural Science Foundation of China(20802006).

重大新藥創(chuàng)制國家科技重大專項(2009ZX09501-002)和國家自然科學(xué)基金(20802006)資助項目