眩燈蛾白僵菌菌株 (兩株)的分離、鑒定及其對棉蚜致病力試驗

孫佰平，徐 強(qiáng)，趙思峰，王佩玲

(1．新疆兵團(tuán)化工綠色過程重點實驗室，新疆石河子832003;2．新疆鄯善縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，新疆鄯善838200;3．石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點實驗室，新疆石河子832003)

新疆是我國最適宜棉區(qū)和最大的優(yōu)質(zhì)商品棉生產(chǎn)基地，每年棉花種植面積穩(wěn)定在140萬km2以上，占新疆總耕地面積的1/3(劉晏良，2006)。在宜棉區(qū)，棉花面積占耕地的比例高達(dá)70%～80% (龔明福等，2007)。棉蚜 Aphis gossypii(Glover)是新疆棉區(qū)最重要的害蟲之一，其發(fā)生范圍遍布南、北疆各棉區(qū) (蘆屹等，2009)，除了直接吸食植物汁液為害外，還分泌大量蜜露粘附在棉花纖維上從而降低纖維品質(zhì)。長期以來，對棉蚜的防治一直以化學(xué)防治為主，大量的、不合理的使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致其抗性發(fā)展速度快，抗性程度高，抗性背景復(fù)雜等 (陸宴輝等，2004)。因此，尋找安全的替代防治措施顯得尤為迫切。由于昆蟲病原微生物具有選擇性強(qiáng)、防效高、生產(chǎn)成本低、不污染環(huán)境、對人畜無害等特點，越來越多的病原微生物被研究開發(fā)并用于害蟲防治。白僵菌是世界各國研究應(yīng)用較多的一類昆蟲病原真菌，可侵染15目149科700多種昆蟲 (Feng et al.，1994)。自馮明光1990年首次發(fā)現(xiàn)其具有殺滅蚜蟲的特性以來，白僵菌防治刺吸式口器害蟲的研究不斷增多，已有大量關(guān)于采用白僵菌防治桃蚜、溫室蚜蟲的報道 (Feng et al.，1990;Zhang et al.，2005)。本文對從眩燈蛾Lacydes spectabilisc(Tauscher)自然死亡幼蟲體上分離獲得的白僵菌進(jìn)行了鑒定，并在室內(nèi)測定了其對棉蚜的致病力，用模型擬合了2個菌株的半致死時間和半致死濃度，從而為進(jìn)一步研究和利用白僵菌防治棉蚜奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離、純化

菌種采集自在新疆古爾班通古特沙漠南緣荒漠植物梭梭Haloxylon ammodendron上取食的眩燈蛾Lacydes spectabilisc(Tauscher)幼蟲僵蟲，采集時間為2007年7月15日，共采集到5頭僵死幼蟲。

1.2 所用培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g;葡萄糖20 g;瓊脂15～20 g;蒸餾水1000 mL。

WA培養(yǎng)基:瓊脂15～20 g;1000 mL。

察氏培養(yǎng)液:硝酸鈉3.00 g;磷酸氫二鉀1.00 g;MgSO4·7H2O 0.50 g;氯化鉀0.50 g;硫酸亞鐵0.01 g;蔗糖30.00 g;蒸餾水1000 mL。

1.3 供試棉蚜及棉花品種

在12 cm×12 cm×10 cm的發(fā)芽盒中依次墊上兩層棉紗和一層濾紙，棉花葉片基部用無菌水浸潤過的脫脂棉包裹，葉面朝下放在濾紙上，再從未施用農(nóng)藥的棉田中采集處于生殖盛期的棉蚜無翅成蟲5頭一組挑于上述葉片上，在20℃繁殖48 h后取出，每片葉上可產(chǎn)若蚜30～50頭，在完成最后一次蛻皮后1～2 d內(nèi)的成蚜作為供試蟲體(袁盛勇等，2010)。棉花品種為新陸早13號，購買于石河子市種子市場。

1.4 菌株的分離純化

采用組織分離法進(jìn)行分離 (陳立杰等，2008)，用滅菌接種針從僵死蟲體上挑取少許菌絲及孢子粉，接種于PDA培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，48 h后用打孔器打出0.7 cm的菌塊接種于WA培養(yǎng)基上進(jìn)行單菌絲分離純化，挑取單根菌絲接種于另一PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48 h，然后轉(zhuǎn)入試管中備用。共獲得2株菌株，分別命名為CXJ－1和CXJ－2。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

將保存的菌株接種于PDA平板上后置于保濕溫箱 (溫度25℃，相對濕度95%)中培養(yǎng)2周，用6.5 g/L且含有0.1%吐溫－80的NaCl溶液沖洗平板表面，將菌絲和孢子液轉(zhuǎn)移至150 mL三角瓶中，加入少量滅菌的玻璃珠，于4℃ 100 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，用四層滅菌紗布過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至滅菌的離心管中在4℃ 4000 r/min離心6 min，之后用無菌水洗滌3～4次后懸浮于6.5g/L且含有0.1%吐溫－80的NaCl溶液中，配成孢子懸浮液，用接種環(huán)分別沾取菌株孢子懸浮液接種于PDA平板上，接種后置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)觀察 (路國兵等，2007)，8 d后記錄并觀察菌落顏色變化和分生孢子的形態(tài)特征 (米紅霞等，2010)。

1.5.2 分離菌株分子鑒定

挑選CXJ－1和CXJ－2兩個菌株進(jìn)行培養(yǎng)和DNA提取。菌株的培養(yǎng)和基因組DNA的提取主要參考方衛(wèi)國 (2002)的方法進(jìn)行。采用真菌通用引物 ITS1(3'－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－5')和ITS4(3'－TCCTCCGCTTATTGATATGC－5')擴(kuò)增菌株的ITS和5.8SrDNA，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系:基因組DNA 2μL、10×PCR buffer 5μL、10mmol/L dNTP1μL、25mmol/L MgCl23μL、25μmol/L ITS1 1μL、25μmol/L ITS4 1μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，加入雙蒸水至終體積為50μL。PCR反應(yīng)條件是94℃ 5min預(yù)變性;94℃ 30s;55℃ 30s;72℃ 40s，進(jìn)行 30循環(huán)后72℃延伸8min。反應(yīng)完成后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步純化后委托生工生物工程 (上海)有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與已報道的Beauveria bassiana的5.8SrDNA以及能夠?qū)е吕ハx死亡的另外3種真菌的18SrDNA用DNAMAN軟件進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)樹，應(yīng)用自展法 (bootstrap)檢驗系統(tǒng)樹，自展數(shù)據(jù)集為1000次。

1.6 兩菌株對棉蚜侵染能力的測定

1.6.1 孢子懸浮液的制備

從在PDA平板上培養(yǎng)48 h的菌落上用滅菌的打孔器分別打取一塊菌餅，接入裝有300 mL察氏培養(yǎng)液的500 mL三角錐瓶中，28℃ 200 rpm搖床上搖床培養(yǎng)4 d。將培養(yǎng)好后的菌液用四層滅菌的紗布過濾，丟棄菌絲，用含有0.5%吐溫－80的無菌水將孢子濃度分別稀釋成4.75×109個/mL、4.75×108個/mL、4.75×107個/mL、4.75×106個/mL和4.75×105個/mL的懸浮液。

1.6.2 對棉蚜侵染能力的測定

試驗采用試蟲浸漬法 (陳立杰等，2008)。在50 mL燒杯中分別加入已配制的5個濃度的菌懸液20 mL，將試蟲用毛筆挑入細(xì)孔紗網(wǎng)中，在孢子懸浮液中浸3～5 s后取出，轉(zhuǎn)移至發(fā)芽盒內(nèi)的新鮮棉花葉片上，每盒蚜蟲40頭，5次重復(fù)，并用0.5%吐溫－80的無菌水作為空白對照，棉花葉片基部包裹浸潤過無菌水的脫脂棉，每2d換一次新鮮葉片，25℃室內(nèi)放置。每天觀察記錄各處理試蟲死亡情況，昆蟲針挑撥不動者即為死亡，將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以不同濃度菌液對棉蚜的殺傷作用以毒力回歸方程、致死中濃度 (LD50)和致死中時間 (LT50)為評價依據(jù)。

1.6.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)所觀察實驗結(jié)果數(shù)據(jù)計算接種后棉蚜的死亡率和侵染率 (Ballard EM et al.，1984;Khalil SK et al.，1985)，并以Abbott公式進(jìn)行校正 (趙文琴等，2001):

以時間 (d)或菌液濃度 (個/mL)的對數(shù)值為X，校正死亡率的幾率值為Y，采用幾率值分析法，通過SPSS 18.0軟件進(jìn)行線性回歸分析 (黃劍等，2004)，建立致病力回歸方程，從而估計劑量效應(yīng)LD50、LT50和相關(guān)系數(shù) R2等參數(shù) (袁勝勇等，2010)，并對兩菌株進(jìn)行毒力比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

觀察所挑選的兩個菌株在PDA平板上的菌落形態(tài) (圖1)產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子，其特征為:CXJ－1菌株菌落色澤白色，基質(zhì)色澤黃色，CXJ－2菌株菌落色澤白色，基質(zhì)色澤淡黃色;無孢梗束，無明顯氣味，菌絲光滑;兩個菌株的產(chǎn)孢細(xì)胞均呈燒瓶形或球形，簇生于菌絲或孢囊梗上;分生孢子球形或是近似球形、單孢、無色透明且光滑。從菌落形態(tài)及產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子的形態(tài)特征初步將其鑒定為白僵菌屬。

圖1 兩株白僵菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig 1 Colonialm orphology of two Beauveria bassiana strains on PDA media

2.2 18Sr DNA序列測定結(jié)果及同源性分析

測序結(jié)果為CXJ－和CXJ－2目標(biāo)片段長度分別為500 bp、506 bp。將兩個菌株測序結(jié)果與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株與白僵菌屬自然聚類，最相近的種的同源性達(dá)到100%。從同源性最高的序列中挑選出4個菌株序列和其他4個昆蟲致病菌屬真菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，CXJ－1和CXJ－2分別與B.bassiana isolate KTU －65(FJ792827)、B.bassiana isolate KTU－66(FJ792828)和B.bassiana isolate G66(GU566276)親緣關(guān)系最近 (圖2)，因此將兩個菌株鑒定為球孢白僵菌B.bassiana。

圖2 菌株CXJ－1和CXJ－2的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Fig.2 Phylogenetic tree based on alignment of strain CXJ－1 and CXJ－2 and other 4 fungi species including ITSI，5.8Sand ITS2 sequencing data

2.3 兩菌株對棉蚜侵染能力的測定

在25℃條件下，兩株球孢白僵菌CXJ－1和CXJ－2對棉蚜均具有有較強(qiáng)的致病力 (圖3)，蚜蟲死亡率隨孢子懸浮液濃度提高和處理后時間延長而增加 (圖4)。濃度為4.75×106個/mL～4.75×109個/mL孢子時兩個菌株接種蚜蟲后2d蚜蟲就開始死亡，但校正死亡率較低。當(dāng)5個處理濃度6d時累積校正死亡率達(dá)到較理想的效果，4.75×105個/mL和4.75×106個/mL濃度死亡率較低，其中4.75×105個/mL濃度最低，兩個菌株的死亡率分別為37.20%和29.32%，濃度為4.75×109個/mL孢子時，兩個菌株累計校正死亡率最高，CXJ－1和CXJ－2分別達(dá)到92.12%、90.88%。隨著時間推移，兩個菌株的致死中濃度LC50逐漸減小，4～7d菌株CXJ－1的LC50依次為5.31×108個/mL、1.50×107個/mL、2.03×106個/mL和 4.37×105個/mL，菌株 CXJ－2的 LC50依次為9.14×108個/mL、3.00×107個/mL、4.84 ×106個/mL 和1.08×106個/mL(表1)。隨著孢子濃度增大，棉蚜LT50逐漸縮短，菌株CXJ－1 5個不同濃度孢子懸浮液的 LT50依次分別為 7.15、5.38、4.75、3.80和3.54d，菌株CXJ－2 5個不同濃度孢子懸浮液的 LT50依次分別為8.16、5.75、4.91、4.09和3.59d(表2)。菌株CXJ－1的LC50和LT50均比菌株CXJ－2的值小，說明棉蚜對菌株CXJ－1更敏感，菌株CXJ－1對棉蚜有更強(qiáng)的的致病力。

圖3 兩株白僵菌對棉蚜致病性效果Fig.3 The effect of two strains against Aphis gossypii

圖4 菌株CXJ－1和CXJ－2兩菌株五個不同孢子懸浮液和對照組 (CK)對棉蚜的室內(nèi)致病力實驗結(jié)果Fig.4 ThevirulenceoffivedifferentconcentrationsofstrainCXJ－1，CXJ－2andCKagainstAphisgossypiiwastested byusinginsectdipbioassayinlaboratory．

表1 兩株球孢白僵菌分生孢子液對新疆棉蚜幼蟲的致病力與致死中濃度Table1 RegressionandmedianlethalconcentrationofthetwostrainstoAphisgossypii

表2 兩株球孢白僵菌分生孢子液對新疆棉蚜幼蟲的致病力與致死中時間Table2 RegressionandmedianlethaltimeofthetwostrainstoAphisgossypii

3 結(jié)論與討論

白僵菌是真菌殺蟲應(yīng)用最多的一個類群，在持續(xù)長久控制害蟲和保持生態(tài)平衡方面具有十分重要的作用，是一類具有實際應(yīng)用價值的殺蟲微生物。本研究從在古爾班通古特沙漠南緣荒漠植物梭梭上取食的眩燈蛾死亡幼蟲上分離獲得了2株致病菌，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，將其鑒定為球孢白僵菌。

棉蚜是新疆棉花的重要害蟲，目前對其防治仍以傳統(tǒng)的化學(xué)防治為主，不僅產(chǎn)生農(nóng)藥殘留，污染環(huán)境，而且易殺傷天敵，破壞生態(tài)平衡。本研究用鑒定的球孢白僵菌感染棉蚜，結(jié)果表明，球孢白僵菌對棉蚜具有很高的殺蟲活性，其中菌株CXJ－1比菌株CXJ－2對棉蚜致病力更有優(yōu)勢，且穩(wěn)定性較好。利用球孢白僵菌防治棉蚜研究的相關(guān)文獻(xiàn)在國內(nèi)外還鮮有報道，本研究所分離球孢白僵菌對棉蚜表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病力，具有較好的應(yīng)用潛力，但田間環(huán)境比室內(nèi)環(huán)境復(fù)雜得多，要進(jìn)一步對其推廣應(yīng)用，還有待于進(jìn)一步深入研究。

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