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    轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2功能片段原核表達載體的構(gòu)建及表達

    2011-11-21 01:12:36趙紅蕾孫月芳田曉豐吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院吉林長春30062
    中國老年學(xué)雜志 2011年16期
    關(guān)鍵詞:原核克隆質(zhì)粒

    趙紅蕾 曹 宏 孫月芳 田曉豐 (吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林 長春 30062)

    轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2功能片段原核表達載體的構(gòu)建及表達

    趙紅蕾 曹 宏1孫月芳1田曉豐1(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林 長春 130062)

    目的 從人正常組織中克隆人轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2功能片段,構(gòu)建其原核表達載體,并在大腸桿菌中進行表達,純化獲得蛋白,用于下一步探討ZHX2基因的功能。方法 根據(jù)GenBank中ZHX2功能片段已知序列設(shè)計引物,從正常人組織中通過RT-PCR方法擴增ZHX2基因功能片段,克隆到原核表達載體pET28a(+)中,轉(zhuǎn)化Ecoli.BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達,采用鎳柱親和層析法純化目的蛋白。結(jié)果 測序結(jié)果顯示克隆的ZHX2基因序列正確,SDS-PAGE鑒定表達產(chǎn)物分子量正確,Western-blot鑒定結(jié)果顯示表達產(chǎn)物為人ZHX2功能片段特異性蛋白。結(jié)論 本研究成功構(gòu)建了含有ZHX2功能片段的原核融合表達載體,并實現(xiàn)了ZHX2功能片段的表達,獲得了純化的蛋白,為進一步研究ZHX2基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

    ZHX2基因;轉(zhuǎn)錄抑制因子;原核表達

    ZHX(zinc-fingers and homeoboxes,ZHX)蛋白家族包括ZHX1、ZHX2和ZHX3,在人體組織中廣泛存在,在組織中作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮重要的病理生理功能〔1,2〕。ZHX2是ZHX蛋白家族成員之一,是2003年新克隆的轉(zhuǎn)錄抑制因子,位于染色體8q24.13,其編碼的蛋白含837個氨基酸殘基,定位于細胞核內(nèi)〔3〕。近年來的研究結(jié)果顯示,ZHX2參與正常肝細胞中肝癌標志物的轉(zhuǎn)錄抑制,提示ZHX2的表達缺失可能是肝細胞癌發(fā)生的關(guān)鍵因素〔4〕。本研究設(shè)計構(gòu)建人ZHX2基因功能片段的原核表達載體,為進一步確定ZHX2蛋白發(fā)揮有效生物學(xué)作用的最小功能片段奠定基礎(chǔ),同時也為進一步研究ZHX2基因的功能提供實驗材料。

    1 材料與方法

    1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)pLysS由本室保存,pMD-18T載體購自Takara公司,原核表達載體pET28a(+)由本室保存。

    1.2 試劑 總RNA提取試劑盒Trizol reagent和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Thermoscript TM RT-PCR SYSTEM為GIBCo BRL公司產(chǎn)品;T4 DNA ligase為Promega公司產(chǎn)品;DL 2000 DNA Marker、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、X-gal、IPTG均購自TaKaRa公司;低分子量蛋白 Marker(97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4 kU)購自上海生物化學(xué)研究所,窄譜預(yù)染蛋白質(zhì)Marker(71、50、35、25、16、8 和 2 kU)購自賽百盛基因技術(shù)有限公司;ZHX2單克隆抗體購自 Santa Cruz Biotechnology公司;HRP兔抗小鼠IgG購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

    1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中人ZHX2 cDNA序列(gi:63079684)使用Prim 5軟件在ZHX2基因的上下游設(shè)計F1和R1兩條引物,上游引物F1:5'GAA TTC GTG ACA GAC ACA GCT GAG ATC C 3';下游引物 R1:5'CTC GAG GCC CCT TTG ACA CCG ATA T 3',分別含EcoR I和Sal I酶切位點,理論擴增目的片段為837 bp,引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

    1.4 人ZHX2基因功能片段的克隆及測序 用Trizol reagent提取人正常肝組織總RNA,具體操作按文獻〔5〕方法進行,沉淀置于室溫干燥后加入30 μl水(含RNase inhibitor l μl)溶解,取3~5 μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢查。立即進行逆轉(zhuǎn)錄或加入2倍體積的乙醇-80℃保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)嚴格按照試劑盒操作說明進行。取RNA 1 μg參照Quant script RT Kit試劑盒說明操作,取Quant Reverse Transcrplase 1 μl以及10×RT mix、dNTP 混合液(2.5 mmol/L)、Random(10 μmol/L) 各2 μl,加 DEPC 水定容至20 μl,37℃孵育60 min。所得 cDNA 用DEPC水稀釋至50 μl置于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增按50 μl體系進行,取2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,以引物F1/R1對RT產(chǎn)物進行擴增,94℃,2 min預(yù)變性;循環(huán)參數(shù)為:94℃ 30 s,58℃30 s,72℃ 80 s,35個循環(huán);然后72℃延伸7 min。擴增結(jié)束后,對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,切膠。用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段,并與pMD-18T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài),PCR及酶切鑒定陽性克隆,初步鑒定成功的pMD-18T-ZHX2質(zhì)粒送大連寶生物公司測序。

    1.5 人ZHX2基因功能片段原核表達載體的構(gòu)建 以EcoR I和Sal I對pMD-18T-ZHX2質(zhì)粒和pET28a(+)載體雙酶切,回收后連接、轉(zhuǎn)換大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆進行PCR和酶切鑒定。鑒定正確質(zhì)粒命名為pET28a-ZHX2。

    1.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達、純化及鑒定 將含有表達載體pET28a-ZHX2的宿主菌接種含卡那霉素(30 μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基,37℃搖震培養(yǎng)至 OD600 0.4~0.6,加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3~5 h,離心收集菌體,加入原培養(yǎng)液1/10體積的0.1 mol/L PBS重懸菌體,-20℃保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)液在4℃、5 500 r/min離心20 min,收集細胞沉淀物,沉淀物經(jīng)超聲裂解后用相同體積的PBS(pH7.0)重懸,沉淀和上清通過12 000 r/min離心20 min進行分離。進行SDS-PAGE檢測分析,產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA樹脂純化。把可溶上清液轉(zhuǎn)移到純化柱上,然后用5倍體積的PBS(pH7.0)溶液沖洗純化柱。目的蛋白分別用含有10、20、50、100 mmol/L咪唑的 PBS(pH7.0)進行梯度洗脫。洗脫液經(jīng)透析、濃縮、過濾除菌,Bradford法測定蛋白濃度后-70℃保存。

    SDS-PAGE按文獻〔5〕方法進行:灌制12%聚丙烯酰胺分離膠和5%的濃縮膠,取收集的上清20 μl和少量上樣緩沖液混勻后上樣,0.25%考馬斯亮藍R-250染色,凝膠成像系統(tǒng)掃描分析表達產(chǎn)物。Western印跡檢測按文獻〔6〕所述方法進行,轉(zhuǎn)膜后在含有5%脫脂牛奶封閉液中封閉1 h,之后膜在1∶1 000的ZHX2單克隆抗體中4℃雜交過夜,第二天用PBS洗3次之后用1∶2 000的HRP標記的兔抗小鼠IgG二抗雜交1 h,PBS洗3次,在ECL儀器上用ECL底物發(fā)光液顯影。

    2 結(jié)果

    2.1 ZHX2的克隆測序結(jié)果 ZHX2基因功能片段RT-PCR擴增后得到特異性的目的片段,結(jié)果如圖1所示,用引物F1/R1進行PCR,得到大小為837 bp的片段,擴增結(jié)果與預(yù)期相符。經(jīng)測序,與GenBank序列信息一致。

    2.2 ZHX2原核表達載體的構(gòu)建和鑒定結(jié)果 菌落PCR結(jié)果表明,插入片段與目的片段大小一致。pET28a-ZHX2重組質(zhì)粒用EcoR I和Sal I雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果表明酶切后的片段大小約3 000 bp和837 bp,說明外源片段已插入。見圖1。

    2.3 ZHX2蛋白的誘導(dǎo)表達和鑒定結(jié)果 pET28a(+)-ZHX2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS進行目的蛋白的誘導(dǎo)表達,在30℃,0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h,誘導(dǎo)的表達產(chǎn)物經(jīng)純化后,取上清液進行SDS-PAGE電泳,結(jié)果顯示有融合蛋白表達,分子質(zhì)量約為31 kD,與預(yù)期相符合。Western印跡結(jié)果顯示,純化后的表達蛋白與商品化的ZHX2單克隆抗體在32 kD處出現(xiàn)特異性條帶。見圖1。

    圖1 ZHX2克隆、pET28a-ZHX2重組質(zhì)粒及ZHX2蛋白誘導(dǎo)表達和蛋白結(jié)果

    3 討論

    ZHX 蛋白家族分子結(jié)構(gòu)中均包括兩個鋅指結(jié)構(gòu)(zinc-finger motifs)和五個同源結(jié)構(gòu)域(homeo domains,HDs)。三種蛋白自身可組成同源二聚體,兩種蛋白相互之間也可形成異源二聚體,ZHX2在肝、腎、脾臟等不同組織中都有很廣泛的表達〔7〕,近期研究顯示ZHX2可能參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展:ZHX2不僅抑制肝癌細胞AFP的表達,而且在腎病綜合征中參與腎小球內(nèi)足細胞的調(diào)控〔8〕;另有研究顯示,ZHX2表達與多發(fā)性骨髓瘤惡性程度及患者愈后呈負相關(guān)〔9〕。上述研究提示ZHX2可能是一個重要的抑癌基因。

    ZHX2和ZHX1具有較高的同源性,在編碼序列和氨基酸序列上的同源性分別為45.5%和41.9%。ZHX2主要定位在核內(nèi),有兩個核定位信號,位于第317位氨基酸和第446位氨基酸之間。ZHX2蛋白間可形成同源二聚體,也可以與同家族成員ZHX1或ZHX3形成異源二聚體,二聚體結(jié)合區(qū)位于HDI(第195位氨基酸和第358位氨基酸之間)。ZHX家族成員結(jié)構(gòu)相似,分子量大小相近。因此,抗原設(shè)計時應(yīng)盡量避開共同或相似結(jié)構(gòu)域。Yamada〔4〕報道,ZHX2蛋白263AA~497AA之間有一個脯氨酸富集區(qū),是不同于ZHX1和ZHX3的一個特殊結(jié)構(gòu)域,通過BLAST對比分析ZHX家族氨基酸序列發(fā)現(xiàn),ZHX2在263AA~497AA區(qū)域內(nèi)較其他成員同源性低。王金金等〔10〕對人的ZHX2基因進行了真核表達,通過對表達結(jié)果的對比分析,將ZHX2的最小抑制區(qū)域縮小到242AA~501AA區(qū)域內(nèi)。本研究根據(jù)上述研究結(jié)果,針對其設(shè)計的抗原片段更易產(chǎn)出特異性強的抗體,原核細胞中表達蛋白純化后免疫動物獲得血清,Western印跡結(jié)果顯示制備的抗體具有良好的特異性。

    ZHX2蛋白全長837個氨基酸,含有多個功能域,但并非所有功能域都具有抑制功能。Kawata等〔3〕構(gòu)建了ZHX2系列缺失表達載體,經(jīng)共轉(zhuǎn)染實驗和報告基因分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZHX2抑制cdc25基因啟動子的最小抑制區(qū)域在氨基酸序列263~446范圍內(nèi),這個區(qū)域包含了整個HD1區(qū)和脯氨酸富含區(qū),但該功能域是否同樣是ZHX2抑制AFP、參與HCC及多種疾病發(fā)生的最小功能域,迄今尚不清楚。本研究根據(jù)ZHX2的編碼序列,成功構(gòu)建了人ZHX2基因功能片段的原核表達載體pET28a-ZHX2,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),在IPTG誘導(dǎo)下實現(xiàn)了目的蛋白的可溶性表達,Western印跡結(jié)果表明,本實驗獲得的表達蛋白為ZHX2基因特異性蛋白,為基因工程生產(chǎn)和改造ZHX2創(chuàng)造了條件,也為進一步闡明ZHX2基因的結(jié)構(gòu)與功能及其在疾病發(fā)生中的作用奠定了基礎(chǔ)。

    1 Aussara Panyaa,Nunghathai Sawasdeeb,Chatchawan Srisawat.Expression of zinc finger and homeobox 2 in erythroleukaemic cells and gamma-globin expression〔J〕.Sci Asia,2010;36:342-5.

    2 Shen H,Luan F,Liu H,et al.ZHX2 is a repressor of Alpha to protein expression in human hepatoma cell lines〔J〕.J Cell Mol Med,2008;12(6B):2772-80.

    3 Kawata H,Yamada K,Shou ZF,et al.Zinc-fingers and homeoboxes(ZHX)2,a novel member of the ZHX family functions as a transcriptional repressor〔J〕.Biochem J,2003;373(Pt3):747-57.

    4 Yamada K,Ogata-Kawata H,Matsuura K,et al.ZHX2 and ZHX3 repress cancer markers in normal hepatocytes〔J〕.Front Biosci,2009;14(1):3724-32.

    5 薩姆布魯克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T,著.金冬雁,黎孟楓,侯云德,譯.分子克隆實驗指南〔M〕.北京:科學(xué)出版社,2002:362-92.

    6 潘 穎,毛麗君,孫艷霞,等.RhoC-miRNA真核表達載體的構(gòu)建及其在卵巢癌細胞系中穩(wěn)定表達〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2009;29(3):277-9.

    7 Perincheri S,Dingle RW,Peterson ML,et al.Hereditary persistence of alpha-protein and H19 expression in liver of BALB/cJ mice is due to a retrovirus insertion in the ZHX2 gene〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2005;102(2):396-401.

    8 Liu C,Clement LC,Kanwar YS,et al.ZHX proteins regulate podocyte gene expression during the development of nephritic syndrome〔J〕.Biol Chem,2007;281(51):39681-92.

    9 Armelliui A,Sarasquete ME,Curca-Suuz R,et al.Low expression of ZHX2,but not RCBTB2 or RAN,is associated with poor outcome in multiple myeloma〔J〕.Br J Haematol,2008;141(2):212-5.

    10 王金金,史 偉,祁建妮,等.轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2功能片段的克隆及表達〔J〕.山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2009;47(5):1-4.

    R996

    A

    1005-9202(2011)16-3115-03

    1 吉林大學(xué)第二醫(yī)院普外科中心

    田曉豐(1976-),男,博士后,主治醫(yī)師,主要從事肝膽胰外科臨床及基礎(chǔ)研究。

    趙紅蕾(1987-),女,碩士,主要從事分子免疫學(xué)研究。

    〔2011-02-15收稿 2011-05-07修回〕

    (編輯 徐 杰)

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