全反式維甲酸對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及α-SMA表達(dá)的影響*

李佳鑫， 海廣范， 賈巖龍， 夏 武， 陳永鳳， 劉巨源△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，2第三附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

全反式維甲酸對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及α-SMA表達(dá)的影響*

李佳鑫1， 海廣范1， 賈巖龍1， 夏 武1， 陳永鳳2， 劉巨源1△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院1藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，2第三附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的研究全反式維甲酸(ATRA)對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞(HFL-I)增殖與分化的影響。方法體外培養(yǎng)HFL-I, MTT法檢測(cè)不同濃度ATRA(0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)作用3 d對(duì)HFL-I增殖能力的影響。5 μg/L 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)刺激0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后，RT-PCR法檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA) mRNA表達(dá)，刺激0 d、1 d、3 d、5 d后，Western blotting法檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá)。不同濃度ATRA干預(yù)，24 h后RT-PCR方法檢測(cè)α-SMA mRNA表達(dá)，3 d后用Western blotting方法檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá)。結(jié)果(1) MTT法檢測(cè)顯示不同濃度ATRA以濃度依賴性方式抑制HFL-I細(xì)胞的增殖(Plt;0.05)。(2)5 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)后，HFL-I細(xì)胞中α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)(Plt;0.05)。(3) ATRA以濃度依賴性方式下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA mRNA和蛋白的表達(dá)(Plt;0.05)。結(jié)論ATRA能夠抑制HFL-I細(xì)胞的增殖和TGF-β1誘導(dǎo)的分化，該作用可能是通過(guò)下調(diào)α-SMA mRNA和蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

肺纖維化； 肌成纖維細(xì)胞； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β； 全反式維甲酸

成纖維細(xì)胞(fibroblast, FB)向肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MB)的分化是肺間質(zhì)纖維化(pulmonary fibrosis, PF)發(fā)生發(fā)展的初始環(huán)節(jié)。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)是MB的標(biāo)志性蛋白[1]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)FB向MB的分化[2]。研究證實(shí)，全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)能抑制多種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖，并具有抗纖維化作用，且無(wú)明顯細(xì)胞毒性[3]。本次試驗(yàn)應(yīng)用體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞(human embryonic lung fibroblasts,HFL-1)的方法，探討ATRA對(duì)其增殖的影響，并初步探討ATRA對(duì)FB分化的影響。

材 料 和 方 法

1試劑與儀器

HFL-I細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；PCR擴(kuò)增所需引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成； ATRA和四甲基偶氮唑鹽 (MTT)購(gòu)自Sigma；TGF-β1購(gòu)自Peprotech； RT-PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；單克隆鼠抗β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz；單克隆鼠抗人α-SMA抗體購(gòu)自Betacellulin；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀均為北京六一儀器廠產(chǎn)品；PCR儀為ABI產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為Thermo產(chǎn)品。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HFL-I細(xì)胞株采用含15%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青霉素(100 kU/L)、鏈霉素(100 mg/L)的MEM培養(yǎng)液，并于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞每2-3 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。5 μg/L TGF-β1刺激0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后，RT-PCR法檢測(cè)α-SMA mRNA表達(dá)，刺激0 d、1 d、3 d、5 d后，Western blotting法檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá)。分組：正常對(duì)照組；5 μg/L TGF-β1組； 10 μmol/L ATRA組； 5 μg/L TGF-β1+ 0.1 μmol/L ATRA組; 5 μg/L TGF-β1+ 1 μmol/L ATRA組; 5 μg/L TGF-β1+ 10 μmol/L ATRA組。24 h后， RT-PCR法檢測(cè)α-SMA mRNA表達(dá)；3 d后， Western blotting 法檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá)。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×107cells/L， 200 μL/well接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，待24 h細(xì)胞貼壁后，加入含0.1% FBS的饑餓培養(yǎng)基同步化處理12 h，之后加入ATRA，使終濃度為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L， 3 d后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL/well，酶標(biāo)儀測(cè)A值，波長(zhǎng)490 nm，計(jì)算ATRA對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率：抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

2.3半定量RT-PCR法檢測(cè)α-SMA mRNA表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)定量。取總RNA 2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，各取2 μL產(chǎn)物進(jìn)行GAPDH和α-SMA的PCR反應(yīng)。GAPDH引物：上游5＇ -CCC ATC ACC ATC TTC CAG GA -3＇，下游5＇-TTG TCA TAC CAG GAA ATG AGC -3＇，擴(kuò)增片段為731 bp；α-SMA引物：上游5＇-CCA GCT ATG TGA AGA AGA AGA GG -3＇，下游5＇- GTG ATC TCC TTC TGC ATT CGG T- 3＇，擴(kuò)增片段為928 bp。GAPDH和α-SMA擴(kuò)增條件為：95 ℃ 預(yù)變性 5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)后72 ℃ 10 min。各取2 μL PCR產(chǎn)物，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相，并以α-SMA與內(nèi)參照GAPDH比值作為半定量依據(jù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4Western blotting檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá) 加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min， 4 ℃ 12 000 r/min 離心5 min，取上清，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。計(jì)算含20 μg總蛋白的溶液體積作為上樣量，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。α-SMA I抗室溫孵育2 h后4 ℃過(guò)夜，HRP標(biāo)記的II抗室溫孵育1 h后，加顯色液發(fā)光，顯影定影。將膠片掃描后用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行各條帶的灰度值測(cè)定，以α-SMA與內(nèi)參照β-actin的比值作為半定量依據(jù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1MTT結(jié)果

0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L ATRA作用3 d后，A值降低，ATRA各濃度組與正常對(duì)照組相比均有顯著差異(Plt;0.05)，但ATRA各濃度組之間無(wú)顯著差異，見(jiàn)表1。

表1 ATRA對(duì)HFL-I細(xì)胞增殖的影響

2RT-PCR結(jié)果

與0 h組相比，HFL-I細(xì)胞經(jīng)5 μg/L TGF-β1刺激24 h后，α-SMA mRNA表達(dá)達(dá)到峰值(Plt;0.05)，隨后逐漸下降，但至72 h時(shí)仍高于0 h組(Plt;0.05)。與TGF-β1組相比，不同濃度ATRA (0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)均可下調(diào)5 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-I細(xì)胞中α-SMA mRNA的表達(dá)(Plt;0.05),見(jiàn)圖1、2。

Figure 1. The effects of TGF-β1 on the expression of α-SMA mRNA in HFL-I cells detected by RT-PCR

3Westernblotting結(jié)果

與0 d組相比，HFL-I細(xì)胞經(jīng)5 μg/L TGF-β1刺激1 d后，α-SMA 蛋白表達(dá)量開(kāi)始增加，隨后持續(xù)升高(Plt;0.05)。與TGF-β1組相比，不同濃度ATRA (0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)均可下調(diào)5 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-I細(xì)胞中α-SMA蛋白表達(dá)(Plt;0.05)，見(jiàn)圖3、4。

Figure 2. Relative content of α-SMA mRNA in TGF-β1-stimulated HFL-I cells treated was detected by ATRA by RT-PCR.1:control;2:TGF-β1;3:10 μmol·L-1ATRA;4:TGF-β1+0.1 μmol·L-1ATRA;5:TGF-β1+1 μmol·L-1ATRA;6:TGF-β1+10 μmol·L-1ATRA±s.n=3.*Plt;0.05 vs control group;△Plt;0.05 vs TGF-β1 group.

Figure 3. The effects of TGF-β1 on the expression of α-SMA in HFL-I cells detected by Western bloltting.

Figure 4. Relative content of α-SMA protein in TGF-β1-stimulated HFL-I cells treated by ATRA was detected by Western blotting.1:control;2:TGF-β1;3:10 μmol·L-1ATRA;4:TGF-β1+0.1 μmol·L-1ATRA;5:TGF-β1+1 μmol·L-1ATRA;6:TGF-β1+10 μmol·L-1ATRA±s.n=3.*Plt;0.05 vs control group;△Plt;0.05 vs TGF-β1 group.

討 論

PF是肺部病變致死的主要原因之一，其病理改變以肺泡上皮細(xì)胞損傷、FB增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)沉積為特征，最終導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)不可逆重構(gòu)，造成呼吸衰竭。但其發(fā)病機(jī)制目前并未完全闡明[4]。膠原是ECM的主要成分，MB是合成和分泌膠原的主要細(xì)胞，其主要特征是α-SMA表達(dá)呈陽(yáng)性[5]，因此MB激活是ECM沉積的主要原因，也是PF發(fā)生發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MB主要是在多種細(xì)胞因子，尤其是TGF-β1的作用下由FB分化來(lái)的[6]。因此若能抑制FB向MB的分化，就可以減輕肺組織中膠原的沉積，從而改善PF，為PF的治療和預(yù)防帶來(lái)福音。

ATRA是維生素A的體內(nèi)活性代謝物，對(duì)多種細(xì)胞的增殖與分化都有影響[7]。ATRA抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制較復(fù)雜，目前認(rèn)為主要是通過(guò)與維甲酸受體(RA)結(jié)合，從而改變基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用的。本研究顯示，不同濃度ATRA均可抑制HFL-I細(xì)胞的增殖。近年來(lái)研究顯示其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有抗纖維化作用，降低TGF-β1、白細(xì)胞介素、血小板源性生長(zhǎng)因子等與纖維化有關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)[8]。ATRA對(duì)于皮膚、肝臟、腎臟等同樣具有良好的抗炎和抗纖維化活性[9]。但ATRA的作用廣泛而復(fù)雜，其能否在體內(nèi)通過(guò)抑制肺成纖維細(xì)胞向肺肌成纖維細(xì)胞分化從而抑制膠原合成，尚不清楚。

在眾多的致纖維化因子中，TGF-β1是重要的上游調(diào)控因子[10]，可促進(jìn)FB向MB分化，其濃度在慢性纖維化疾病患者血清中約為5 μg/L。本研究顯示5 μg/L TGF-β1可增加HFL-I細(xì)胞中α-SMA表達(dá)(Plt;0.05)，表明部分FB已分化為MB，這與Hashimoto等[11]的研究一致。不同濃度ATRA均可下調(diào)5 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-I細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)(Plt;0.05)，并呈濃度依賴性，表明ATRA能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的FB向MB的分化。MB數(shù)量的減少，必然帶來(lái)膠原合成能力的減弱，最終使ECM合成減少，纖維化程度減輕，PF得到改善，這可能是ATRA抗纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。目前治療肺纖維化的藥物仍以糖皮質(zhì)激素為主，但由于炎癥并非PF的主要病因，因此包括維甲酸在內(nèi)的具有抗纖維化進(jìn)程的藥物越來(lái)越受到人們重視。但ATRA是通過(guò)何種途徑抑制FB增殖及分化，從而降低膠原合成，改善PF，詳細(xì)機(jī)制有待深入研究。

綜上所述，肺纖維化時(shí)，以TGF-β1為主的細(xì)胞因子表達(dá)量增加，導(dǎo)致FB向 MB分化，膠原過(guò)度沉積，肺結(jié)構(gòu)不可逆重構(gòu)；ATRA可能通過(guò)抑制FB的分化，降低膠原的合成，改善肺纖維化。

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Effectofall-trans-retinoicacidontheproliferationandexpressionofα-SMAinhumanembryoniclungfibroblasts

LI Jia-xin1, HAI Guang-fan1, JIA Yan-long1, XIA Wu1, CHEN Yong-feng2, LIU Ju-yuan1

(1DepartmentofPharmacology,2DepartmentofRespiratoryMedicine,ThirdAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China.E-mail:liujuyuan@xxmu.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of all-trans-retinoic acid (ATRA) on the proliferation and differentiation of transforming growth factor β1(TGF-β1)-stimulated human embryonic lung fibroblasts (HFL-I).METHODSThe HFL-I cells were culturedinvitroand were pretreated with ATRA for 3 days at the concentrations of 0.1 μmol/L, 1 μmol/L and 10 μmol/L. The proliferation of HFL-1 cells was detected by MTT method. The mRNA expression of α-smooth muscle actin(α-SMA) in HFL-I cells stimulated with TGF-β1for 0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h was detected by RT-PCR and the protein expression of α-SMA at the time points of 1,3 and 5 days was detected by Western blotting. The mRNA expression of α-SMA in HFL-I cells pretreated with different concentrations of ATRA for 24 h was detected the by RT-PCR and the protein expression at time point of 3rd day was detected by Western blotting.RESULTSDifferent concentration of ATRA inhibited the proliferation of HFL-I in a dose-dependent manner (Plt;0.05). Both mRNA and protein expression of α-SMA in HFL-I cells pretreated with TGF-β1was up-regulated (Plt;0.05). ATRA down-regulated the mRNA and protein expression of α-SMA induced by TGF-β1in a dose-dependent manner (Plt;0.05).CONCLUSIONATRA inhibits the proliferation and TGF-β1-stimulated differentiation in HFL-I cells by down-regulating the mRNA and protein expression of α-SMA.

Pulmonary fibrosis; Myofibroblast; Transforming growth factor beta; All-trans-retinoic acid

1000-4718(2011)04-0787-04

R966

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.032

2010-09-30

2010-12-31

河南省教育廳自然科學(xué)研究資助項(xiàng)目(No.2009A310007)

△通訊作者Tel：0373-3029101 ; E-mail：liujuyuan@xxmu.edu.cn