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    基于DPO引物的多重PCR在檢測單增李斯特菌中的應用

    2011-11-18 06:23:30劉純真王云龍景建洲
    湖北農業(yè)科學 2011年15期
    關鍵詞:引物

    劉純真 王云龍 景建洲

    摘要:根據單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的hly、prfA和iap基因設計了3對常規(guī)引物和DPO(Dual priming oligonucleotide)引物,采用多重PCR的方法,建立了單增李斯特菌的快速檢測體系,并比較了常規(guī)引物和DPO引物的優(yōu)劣,結果表明DPO引物的特異性強,能夠快速準確地檢測單增李斯特菌。

    關鍵詞:單增李斯特菌;DPO(Dual priming oligonucleotide)引物;多重PCR

    中圖分類號:R378文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2011)15-3197-04

    Multiplex PCR for Detection of Listeria monocytogenes with DPO Primers

    LIU Chun-zhen1,WANG Yun-long2,JING Jian-zhou1

    (1. Food and Bioengineering School Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China;

    2. Henan Bioengineering Technology Research Center, Zhengzhou 450002, China)

    Abstract: Dual priming oligonucleotide(DPO) primers of three genes, hly, prfA and iap, of Listeria monocytogenes were applied for the detection of L. monocytogenes by multiplex polymerase chain reaction(PCR), and compared with 3 pairs of regular primers. The results showed that DPO primers had high specificity compared with conventional PCR primers, could detect L. monocytogenes accurately and quickly.

    Key words: Listeria monocytogenes; DPO(Dual priming oligonucleotide) primers; multiplex PCR

    單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,簡稱單增李斯特菌)是危害公共衛(wèi)生和食品行業(yè)的一種重要人畜共患病致病菌,使人和動物患腦膜炎、腦炎、敗血癥及造成孕婦流產、死胎等疾病,病死率很高。它能夠耐受低pH、高鹽環(huán)境,并且能在較寬溫度范圍內生長[1]。近年來,很多的突發(fā)病例都與消費的食品被單增李斯特菌污染有關。因此,快速、準確地檢測單增李斯特菌對于預防這些疾病的發(fā)生至關重要。目前,PCR技術被廣泛應用于單增李斯特菌的檢測。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎上改進并發(fā)展起來的一種新型PCR擴增技術,是在同一反應體系中加入多對引物同時擴增多條目的DNA片段的方法[2],采用這一技術可同時檢測多種病原微生物。多重PCR雖為一種特異靈敏、簡便快速、高通量的檢測技術,但如果實驗條件控制不當,很容易導致擴增失敗或非特異性產物[3];引物的設計及靶序列的選擇不當等都可能降低其靈敏度和特異性。

    近年來,一種新興的DPO(Dual priming oligonucleotide)技術,既可保證擴增的特異性,又可大大提高擴增效率,為多重PCR技術的應用提供了新的前景[4]。本研究采用DPO技術,建立了多重PCR檢測體系,以達到快速準確檢測單增李斯特菌的目的。

    1材料與方法

    1.1材料與儀器

    菌種:單增李斯特菌(GIM1.228)購于廣東省微生物菌種保藏中心;試劑:10×PCR buffer、Taq DNA聚合酶購于北京百泰克生物技術有限公司;DNA Marker購于寶生物工程有限公司;設備:梯度PCR儀(美國ABI公司),凝膠成像系統(tǒng)(美國ULTRA. LUM.Inc)。

    1.2引物的設計與合成

    根據單增李斯特菌的hly、prfA、iap基因的保守序列[5-7]分別設計3對常規(guī)引物以及相應的DPO引物,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,具體如下(表1)。

    1.3實驗方法

    1.3.1單增李斯特菌DNA的提?。茫瑁澹欤澹保埃胺ㄌ崛卧隼钏固鼐模危粒郏福?。Chelex-100作為一種離子螯合劑,由苯乙烯和苯二乙烯組成。其懸液在堿性環(huán)境(pH 10~11)和100 ℃的條件下,可導致細胞膜的破裂和DNA的變性并釋放出來。①取適量細菌到1.5 mL離心管中,加入500 μL純水,劇烈振蕩,室溫下放置15 min。②12 000 r/min離心3 min,去上清,收集沉淀(必要時可用蒸餾水反復洗沉淀物,直至無色或色素很少)。③沉淀中加入200 μL 5% Chelex-100溶液(使用前充分振搖,使Chelex-100顆粒懸浮),在振蕩器上反復振蕩,56 ℃保溫30 min以上。④取出后振蕩,100 ℃保溫8 min,振蕩后12 000 r/min離心3 min,取上清液用于PCR擴增,或放4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.23重PCR反應條件的優(yōu)化以單增李斯特菌DNA為模板,分別對常規(guī)引物和DPO引物的3重PCR的反應條件進行優(yōu)化并比較。反應體系為25 μL,包括10×PCR buffer 2.5 μL,25 mmol/L Mg2+ 2.0 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL,3對10 μmol/L引物各0.5 μL,3 U/μL Taq DNA 聚合酶0.5 μL。對PCR反應的退火溫度、Mg2+濃度、引物濃度等進行優(yōu)化。

    1.3.3DPO引物與常規(guī)引物的特異性檢測以金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌亞Ⅰ型、金黃色葡萄球菌亞Ⅱ型、沙門氏菌、乙型沙門氏菌、甲型沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、威爾氏李斯特菌、痢疾志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌(肉中提取、JM109、ATCC25922、大腸桿菌O157)的DNA為模板,分別用3個基因的常規(guī)和DPO引物進行PCR擴增,所得的PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    1.3.4DPO引物多重PCR的靈敏度檢測將單增李斯特菌標準菌株培養(yǎng)至對數期,通過LB瓊脂平板計數測菌落數。將菌樣分別用超純水進行倍比稀釋,12 000 r/min離心2 min,采用Chelex-100法抽提DNA。PCR反應程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,58 ℃退火40 s,72 ℃延伸50 s,30個循環(huán);72 ℃延伸7 min。?。校茫耶a物7 μL進行瓊脂糖凝膠電泳(60 V 1 h),照相觀察和分析。

    2結果與分析

    2.13重PCR反應條件

    2.1.1退火溫度對常規(guī)引物和DPO引物的3重PCR的退火溫度進行優(yōu)化,電泳結果見圖1、圖2,兩種引物在55~59 ℃之間都能擴增出目的條帶,但DPO引物擴增出的條帶亮度更好。

    2.1.2Mg2+ 濃度對常規(guī)引物和DPO引物的3重PCR的Mg2+濃度進行優(yōu)化,電泳結果見圖3、圖4。Mg2+濃度較低時,兩種引物都僅能擴增出2條目的條帶;Mg2+濃度大于2.5 mmol/L時,DPO引物擴增出3條目的條帶,而常規(guī)引物擴增出非特異性條帶。由此可見Mg2+對DPO引物的影響較小,用DPO引物擴增時,在較高Mg2+濃度條件下也能保證擴增的特異性。此后的反應中,在25 μL 3重PCR反應體系中添加Mg2+濃度為1.8 mmol/L。

    2.1.3引物濃度由圖5和圖6可知,不同濃度的常規(guī)引物和DPO引物都能擴增出3條目的條帶,都有很強的特異性。此后的反應中,在25 μL 3重PCR擴增體系中添加3種引物的上下游引物濃度都為200 nmol/L。

    2.2DPO引物與常規(guī)引物特異性比較

    對常規(guī)引物和DPO引物的特異性檢測結果見圖7和圖8。DPO引物僅在單增李斯特菌擴增出目的條帶,而常規(guī)引物在大腸桿菌(肉中提?。?、威爾氏李斯特菌和宋氏志賀氏菌中均有非特異性條帶出現。因此,DPO引物的特異性要強于常規(guī)引物。

    2.3DPO引物與常規(guī)引物靈敏度的比較

    LB瓊脂平板計數法測得單增李斯特菌的菌體濃度約為108 CFU/mL。將菌液稀釋,分別用常規(guī)和DPO引物進行3重PCR擴增。從圖9、圖10可以看出常規(guī)和DPO引物擴增單增李斯特菌的檢測靈敏度都為107 CFU/mL,沒有太大差別。DPO多重PCR體系中菌體稀釋到100倍以后就沒有條帶出現,并沒有表現出優(yōu)勢,這可能與DPO引物的結構有關,需要進一步研究。

    3結論

    DPO引物具有特殊的結構,引物自身以及引物之間很少形成二級結構,試驗過程中不需要對引物進行篩選,從而可以簡化操作步驟[9]。DPO引物特異性強,與模板發(fā)生錯配的幾率很小,一旦有3個以上堿基錯配,就不會成功擴增[10]。本研究中DPO引物與常規(guī)引物相比,在退火溫度上沒有表現出很大的優(yōu)越性,但對Mg2+濃度不敏感,在高Mg2+濃度下還能保證擴增特異性。

    本研究建立的DPO多重PCR方法可在較短時間內準確地完成對單增李斯特菌的檢測。其與常規(guī)引物的對比表明DPO引物具有很強的特異性,DPO引物的應用可以解決限制多重PCR發(fā)展的非特異性問題,具有較強的應用價值。

    參考文獻:

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    [4] CHUN J Y,KIM K J,HWANG I T,et al. Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene[J]. Nucleic Acids Research,2007,35(6):e40.

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    [9] KIM J K,LEE H J,LEE Y J,et al. Direct detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants by a multiplex PCR using dual-priming oligonucleotide primers[J]. Journal of Virological Methods,2008,149(1):76-84.

    [10] 劉梅,黃新,馬占鴻,等. 應用DPO引物檢測馬鈴薯病毒的多重RT-PCR技術研究[J]. 植物病理學報,2009,39(4):431-444.

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