植物位點特異性甲基化研究的引物設計及PCR體系優(yōu)化

王鶴潼，宋　婕，崔偉娜，曹　霞，何　蕾，賈春云，惠秀娟，臺培東，成智博，劉　宛*

（1.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點實驗室，沈陽 110016；2.遼寧何氏醫(yī)學院，沈陽110163；3.遼寧大學，沈陽 110036；4.上海應用技術學院，上海 201418；5.沈陽農業(yè)大學，沈陽 110866；6.通遼市農業(yè)科學研究院蔬菜所，內蒙古通遼 028000）

植物位點特異性甲基化研究的引物設計及PCR體系優(yōu)化

王鶴潼1，2，宋婕3，崔偉娜4，曹霞5，6，何蕾3，賈春云1，惠秀娟1，臺培東1，成智博1，劉宛1*

（1.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點實驗室，沈陽 110016；2.遼寧何氏醫(yī)學院，沈陽110163；3.遼寧大學，沈陽 110036；4.上海應用技術學院，上海 201418；5.沈陽農業(yè)大學，沈陽 110866；6.通遼市農業(yè)科學研究院蔬菜所，內蒙古通遼 028000）

通過設計大量引物，探索在植物甲基化引物設計中長、短引物的設計方法及其相應的PCR條件，同時比較不同Taq酶對甲基化率影響。結果表明：17～30 bp短引物適合使用Touch-down程序PCR，但特異性差、成功率低；31～50 bp長引物使用55℃退火60℃延伸的PCR條件成功率最高，其中反向引物的長度及Tm小于正向引物較佳；高保真酶因其3′→5′外切酶活性不宜用于甲基化研究，而EpiTaqTMHS在PCR結果中表現(xiàn)最佳。

植物甲基化；引物設計；Taq酶；PCR條件

王鶴潼，宋婕，崔偉娜，等.植物位點特異性甲基化研究的引物設計及PCR體系優(yōu)化［J］.農業(yè)環(huán)境科學學報，2016，35（9）：1686-1693.

WANG He-tong，SONG Jie，CUI Wei-na，et al.Primer design and PCR condition optimization for plant site-specific methylation［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（9）：1686-1693.

表觀遺傳修飾是一種不同于核苷酸序列的可遺傳信息，主要包括DNA甲基化和組蛋白修飾，研究發(fā)現(xiàn)其在植物生長發(fā)育、基因表達調控以及抗逆脅迫中起著至關重要的作用［1-2］。DNA甲基化廣泛存在于多種有機體中，且多數(shù)發(fā)生在胞嘧啶第5碳原子上形成5-甲基胞嘧啶。在植物中，DNA甲基化是一種普遍現(xiàn)象，20%～30%的基因組胞嘧啶處于甲基化狀態(tài)，并分布于CG、CHG、CHH位點（H代表A、G或T）［3-5］。隨著人們對植物DNA甲基化研究愈來愈關注，開發(fā)出眾多檢測DNA甲基化的方法。根據(jù)研究內容和目的的不同，可分為檢測全基因組甲基化和位點特異性甲基化兩類方法，其中前者主要以高效液相色譜法［6］、基于甲基化敏感內切酶（如：Methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP［7］和Methylation-sensitive arbitrarily primed PCR，MSAP-PCR［8-10］等）和基于South ern探針雜交（如：CGI array和cDNA microarray等）［2］的方法為主，由于芯片技術需要開發(fā)大量探針且成本較高，而高效液相色譜法條件優(yōu)化較復雜，因此在植物研究中多數(shù)使用基于甲基化敏感內切酶的方法。

在位點特異性甲基化研究中，以使用重亞硫酸鹽限制酶組合分析［11］（COBRA）、甲基化特異性PCR［12］（MSP）和重亞硫酸鹽測序法（Bisulfite Sequencing）［13-15］為主。隨著DNA測序技術發(fā)展，由于植物基因組CG含量較高而無法使用焦磷酸測序，重亞硫酸鹽測序法的檢測效率和準確性均高于COBRA法和MSP法，目前位點特異性甲基化研究中重亞硫酸鹽測序法的使用最為廣泛［16-17］。然而，隨著該方法在植物上的不斷應用，發(fā)現(xiàn)其中仍然存在一些較棘手的技術性問題，即DNA目的片段重亞硫酸鹽修飾后擴增結果不理想和測序后甲基化率不穩(wěn)定，其中涉及引物的設計、PCR條件的優(yōu)化和Taq酶的選擇三個方面［18］。由于植物基因組CG含量與動物及人相比較高［19］，基因組修飾后重復序列過多，導致應用該方法時在設計引物和選擇目標區(qū)域上會受到極大限制，同時還因所需目的基因區(qū)域的范圍限制，導致所設計引物的Tm、特異性和穩(wěn)定性不佳，使其在修飾后的DNA上不易擴增。另外，我們還發(fā)現(xiàn)不同的Taq酶對測序后的DNA甲基化率有明顯影響，而這些問題都讓植物甲基化研究受到阻礙。因此，本研究從完善方法著手，首次通過分析不同引物設計方式和不同引物擴增體系對甲基化結果的影響，優(yōu)化植物研究中重亞硫酸鹽測序法的實驗條件，最終建立一個兼顧實驗操作性和結果穩(wěn)定性的重亞硫酸鹽測序法實驗體系，為植物的位點特異性甲基化研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1植物材料的培養(yǎng)與處理

選用哥倫比亞型擬南芥種子，經(jīng)10%次氯酸鈉消毒后，于滅菌超純水中4℃浸種24 h打破春化。浸種后在無菌臺上將種子轉移至滅菌后0.5×MS培養(yǎng)基（0.5%蔗糖）中，并于21℃、10 h光照培養(yǎng)15 d［9］。

1.2DNA的提取

將不同培養(yǎng)罐中的幼苗混合，使用北京康為世紀生物科技有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒（CW0531）提取混合幼苗地上部DNA，然后使用Eppendorf Biophotometor Plus檢測DNA含量，根據(jù)測定結果上樣50 ng DNA進行瓊脂糖電泳，用TaKaRa DL2000 DNA Marker進行含量校準并分裝成每管1 μg，-70℃冰箱保存。

1.3重亞硫酸鹽測序法

按照說明書使用 EZ DNA Methylation-GoldTMKits（Zymo research）修飾 100 ng DNA。根據(jù)TAIR （www.tair.org）擬南芥DNA序列數(shù)據(jù)庫，使用Primer 5和Oligo 7自設計引物PCR擴增錯配修復基因MLH1、MSH2、MSH6和MSH7啟動子片段（引物序列及PCR條件詳見“結果與分析”）；擴增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖（TaKaRa）凝膠電泳檢測；目的片段使用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit回收純化；純化后的PCR片段連接載體后克隆測序（上海英駿生物技術有限公司）。

2　結果與分析

2.1植物甲基化研究中短引物的設計與應用

由于植物核基因組CG含量較高，修飾后造成基因組存在大量重復序列使引物特異性降低，因此本實驗室為研究脅迫誘導擬南芥幼苗錯配修復基因啟動子甲基化變異，設計了大量長度在17～30 bp的正、反向引物，發(fā)現(xiàn)其中僅有3對引物MLH1-1F/MLH1-1R、MLH1-410F/MLH1-410R和MSH6_P6F/MSH6_P6R3（表1）擴增出所需目的片段，且擴增穩(wěn)定（圖1）。通過比較引物相關信息，發(fā)現(xiàn)這3對成功擴增的引物，其正向引物的長度和Tm均大于反向引物（表1），說明在正、反向引物的設計上，需要反向引物的長度短于正向引物，前者可以優(yōu)先退火結合模板；而正引物較長，可增加引物的特異性，其Tm高于反向引物利于在反向引物擴增后，迅速結合反向引物所在的模板鏈，最終完成整個PCR過程。

圖1表明，在PCR擴增條件優(yōu)化上，通過使用多種方式擴增后發(fā)現(xiàn)，Touch-down對于這三種甲基化短引物的擴增均有較好的效果：引物MLH1-1F/MLH1-1R使用55℃退火30 s，且每個循環(huán)降0.5℃，運行17個循環(huán)，然后47℃退火30 s運行21個循環(huán)為退火條件；引物MLH1-410F/MLH1-410R使用55℃退火30s，且每個循環(huán)降1℃，運行11個循環(huán)，然后45℃退火30 s運行27個循環(huán)為退火條件；引物MSH6_P6F/ MSH6_P6R3使用56℃退火30 s，且每個循環(huán)降0.5℃，運行9個循環(huán)，然后52℃退火30 s運行30個循環(huán)為退火條件。

表1　實驗中自設計的甲基化短引物Table 1 Self-designed short primers for methylation in this study

圖1　自設計短引物電泳驗證Figure 1 Electriphoresis validation of products amplified by 3 pairs of short，self-designed primers

該結果說明，甲基化短引物設計的實現(xiàn)需對應優(yōu)化PCR條件，根據(jù)正、反向引物的Tm決定Touchdown程序的遞降范圍，原則上Touch-down程序退火最高溫度設定于正、反向引物Tm之間，不可超過反向引物Tm過多，最低退火溫度與最高退火溫度之差原則上小于10℃。而且，引物3′端的ΔG需要低于普通PCR引物，更利于甲基化引物退火后快速引發(fā)延伸反應。

結果還發(fā)現(xiàn)，雖然引物MSH6_P6F/MSH6_P6R3能夠擴增出較穩(wěn)定的PCR產(chǎn)物，且與DNA marker比較后其片段大小也與目的片段基本相似，但經(jīng)過克隆測序并與NCBI數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)，所擴增的序列與葉綠體DNA高度同源（圖2），并非所需目的基因MSH6的PCR片段。這說明甲基化短引物仍存在弊端，無法避免基因組修飾后導致的引物特異性嚴重下降。

2.2植物甲基化研究中長引物的設計與應用

由于甲基化短引物無法避免基因組修飾后導致的引物特異性嚴重下降，致使PCR產(chǎn)物可能為非目的片段。為了克服該問題，本研究設計了大量長度為31～50 bp的長引物。表2中提供了部分該實驗中的自設計引物，其中覆蓋了擬南芥MSH2和MSH7基因的啟動子區(qū)0～-600，且每個基因含有2對有效引物，表2中帶“*”號引物為有效引物，其中dMSH2-11F/ dMSH2-5R和dMSH2b-7F/dMSH2b-4R為MSH2基因啟動子引物，dMSH7-3F/dMSH7-2R和dMSH7b-4F/dMSH7b-2R為MSH7基因啟動子引物。根據(jù)實驗結果該4對引物均為有效擴增（圖3），且經(jīng)測序比對驗證是目的片段。

由于引物長度的加大可以使引物特異性得到很大的提升，正向引物已很難非特異性的結合非對應模板。根據(jù)短引物設計所得經(jīng)驗，在設計引物中依然盡量保持反向引物的長度小于正向引物，至少保證絕對不大于正向引物長度。結合表2和圖3結果分析，表明反向引物僅需不大于正向引物，兩者Tm僅需相差不大，且有較低的3′端ΔG，便可擴增出目的片段。在引物的PCR程序選擇上，通過對各種方式的嘗試，最終發(fā)現(xiàn)，使用55℃退火30 s、60℃延伸2 min適合甲基化長引物擴增，而且其特異性和穩(wěn)定性較高。

圖2　引物MSH6_P6F/MSH6_P6R3擴增產(chǎn)物Blast驗證Figure 2 Blast validation of PCR products amplified by primers MSH6_P6F/MSH6_P6R3

表2顯示，隨著引物加長，不可避免的問題便是引物中覆蓋了許多可修飾位點，但這些位點是否被修飾未知，因此只能通過使用簡并堿基代替。過多的簡并會導致引物的特異性和穩(wěn)定性下降，因此本實驗在設計引物時，每個引物均設計成3～6對簡并形式（表2）。通過比較有效引物和無效引物，在我們成功擴增的4對引物中，發(fā)現(xiàn)并非所有可修飾位點全部簡并是最佳的，其3′端需要簡并，尤其是3′端的前1/3部分，然而其前3個堿基不能出現(xiàn)可修飾位點；其他位置的可修飾位點并無明顯的規(guī)律，一般情況下非5′端連續(xù)3個可修飾位點的堿基需要簡并，同時連續(xù)可修飾位點應避開3′端。

2.3不同Taq酶對甲基化率的影響

本實驗室對擬南芥錯配修復基因的甲基化研究發(fā)現(xiàn)，不同的Taq酶對PCR擴增效果和甲基化率有明顯的差別。因此本實驗選用3種不同類型的Taq酶（表3）對相同DNA的MLH1基因啟動子進行擴增，結果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)PrimeSTARHS所得結果的甲基化率遠大于其他兩種Taq酶，而專為重亞硫酸鹽修飾模板擴增開發(fā)的EpiTaqTMHS比常規(guī)的TaKaRaTaq的甲基化率略高。該結果表明，高保真酶PrimeSTARHS由于其結果過高并不適合于甲基化研究，而TaKaRaTaq由于其酶能力所限，無法檢測出目的片段內全部甲基化變異位點。

3　討論

3.1引物設計及優(yōu)化在植物位點特異性甲基化研究中的重要性

圖3　自設計長引物電泳驗證Figure 3 Electriphoresis validation of products amplified by 4 pairs of short，self-designed primers

隨著分子生物學和生物技術的高速發(fā)展，對于一般生物科學研究而言，實驗中使用的關鍵技術已不再是制約，而且各類儀器、技術服務以及試劑盒的開發(fā)極大地方便了科學研究并簡化了實驗過程。因此，實驗和研究人員所面臨的難題便是課題或實驗的設計，以及方法或技術的選擇和優(yōu)化［20］。對于植物位點特異性甲基化研究而言，其特異性位點的引物設計、選擇和優(yōu)化便是難點。

表2　實驗中自設計的甲基化長引物Table 2 Self-designed long primers for methylation in this study

表3　本研究所選用的Taq酶Table 3 Taq polymerase used in this study

一方面，由于植物基因組CG含量較高［19］，導致經(jīng)過重亞硫酸鹽修飾后基因組重復序列過多，引物結合模板的特異性下降，而且胞嘧啶過多也給設計引物造成較大的困難，因為在指定的區(qū)域或范圍內，很難找到較優(yōu)異的引物。另一方面，由于PCR擴增的模板是修飾過的，與原DNA差異較大，網(wǎng)上并沒有相關的數(shù)據(jù)庫，也無法對所設計的引物進行特異性分析（Primer-blast），只有通過PCR實踐檢測驗證。這些原因均極大地阻礙了實驗的進度和研究的開展，導致即使擁有高效的DNA提取、修飾及純化的試劑盒，實驗卻仍然停滯不前。因此，在植物位點特異性甲基化研究中，引物的設計和優(yōu)化尤為重要。

3.2植物位點特異性甲基化的引物設計

圖4　3種Taq酶擴增修飾后擬南芥MLH1基因啟動子的甲基化結果Figure 4 Methylation profile of Arabidopsis MLH1 promoter amplified by 3 Taq polymerase after sodium bisulfite modification

本實驗室主要研究Cd脅迫下擬南芥的遺傳損傷［9-10，21-22］，其中包括對錯配修復基因表觀遺傳損傷的研究，并為此設計了大量的引物。然而經(jīng)PCR擴增檢驗的結果并不理想，約20余對短引物（17～30 bp）中，僅有3對成功擴增（表1）。通過整理引物并總結經(jīng)驗，我們發(fā)現(xiàn)主要原因在于引物的特異性上，由于引物長度較短，修飾的DNA重復序列高，導致引物的非特異性極高，這便使目的片段很難擴增。然而根據(jù)這些所設計引物，我們對有效引物和失敗引物進行了比較分析，得到了一些有用的經(jīng)驗。我們發(fā)現(xiàn)正向引物的長度和Tm需要大于反向引物，且3′端ΔG也要保持較低（-6.0 kcal·mol-1左右），這樣引物的成功率會顯著提升（表1）。該現(xiàn)象是因為甲基化引物PCR與常規(guī)PCR有一重要區(qū)別，便是在實際擴增過程中只利用了一條鏈作為模板，即單鏈擴增，而與該模板鏈對應的引物便是反向引物，故在設計引物時，首先需考慮的便是讓反向引物更易退火且特異性較高。反向引物長度短于正向引物，便會先于正向引物退火結合到模板上；同時因3′端ΔG較低，會讓引物退火后快速有效的引發(fā)延伸反應，而正向引物盡管Tm高于反向引物，但因引物長度大導致其引物特異性略高，且沒有對應模板，不易退火。當反向引物擴增后，正向引物的高Tm會迅速讓其退火反向引物擴增鏈，并保持高于反向引物的退火能力及延伸能力，這樣可盡量保持兩條引物的同步擴增，又不至于單條鏈過于富集造成PCR效率下降。

在成功擴增產(chǎn)物的引物中，經(jīng)測序比對驗證仍有非目的片段的擴增（圖2），因此短引物用作甲基化引物依然存在弊端。為此本實驗室又設計了大量長引物（31～50 bp）。根據(jù)表2發(fā)現(xiàn)，除不同簡并形式外，長引物的成功率可在50%以上，其中設計引物原則基本與短引物保持一致，即反向引物更易于結合模板。另外，引物除5′端外要保持較低ΔG，即在引物內部穩(wěn)定性上（Internal stability）呈“W”型，并且不能存在ΔG過低的發(fā)夾或二聚體。另一方面，由于引物過長必然導致覆蓋較多的可修飾位點，引物當中的可變堿基需要簡并，然而不同的簡并形式會對PCR擴增造成直接影響。根據(jù)經(jīng)驗我們發(fā)現(xiàn)3′端若有可修飾位點則必須簡并，但該狀況越少越好，因為它直接影響引物延伸反應的引發(fā)，但是3′末端的前3個堿基不允許存在可修飾位點。另外，需要避免2個堿基以上的連續(xù)可修飾位點，且不應出現(xiàn)在3′端，如含有則須簡并。終上所述，雖然長引物依然存在一些不可控因素，但與短引物相比，其引物設計成功率已得到極大提升，并且通過選擇適合的PCR程序和Taq酶也可在一定程度上提高其成功率。

3.3PCR程序和Taq酶的選擇

圖1結果表明，短引物擴增所使用的PCR程序是Touch-down模式。在該方式下，設定的起始退火溫度高于反向引物的Tm，使反向引物能有較高的特異性，而該溫度低于正向引物Tm，可在反向引物延伸后迅速以其為模板進行擴增。隨著前幾輪擴增，使有義模板富集，此時退火溫度已下降，可增加PCR擴增的整體效率以便得到較高含量的目的片段。但是，因為退火溫度只是影響PCR效率的次要因素，如果引物特異性差，PCR程序如何優(yōu)化也于事無補，所以長引物的選用成必然趨勢。

表2和圖3結果表明，通過多種方式的嘗試和驗證，最終發(fā)現(xiàn)長引物的PCR程序如下：95℃變性30 s，55℃退火15～30 s，60℃延伸2～3 min。在該PCR程序中，選用長退火或延伸時間會造成PCR總時間過長而引起酶活力下降，因而需要根據(jù)不同Taq酶的擴增能力（主要指單位時間擴增片段長度）和活力的持久度，決定退火及延伸時間，此PCR條件與Henderson等［18］所用方法相似。該PCR條件的優(yōu)點是，對于Tm較高的長引物，55℃會讓引物迅速地在高特異性和穩(wěn)定性的位點上退火，然后在60℃進行邊退火邊延伸，這樣可使一些低穩(wěn)定性和可修飾的位點繼續(xù)退火，也可進行較穩(wěn)定的延伸。然而缺點便是PCR程序時間過長且對酶的性能要求較高，因為60℃并不是Taq最佳溫度，在該溫度下其延伸效率不足72℃的一半，致使延伸時間過長，而普通的Taq在2 h后性能會明顯下降，最終影響PCR的效果。

圖4結果表明，在Taq酶的選擇上，PrimeSTAR HS并不適合甲基化PCR，因為所有的高保真酶都含有3′→5′核酸外切酶活性，而尿嘧啶與胸腺嘧啶相比少一個甲基，雖然在堿基配對時也可形成兩個氫鍵，但形成雙鏈螺旋結構時并不穩(wěn)定，可能會影響高保真酶的擴增，甚至會誤認其是錯配而將其外切掉，導致已修飾位點不易擴增而含甲基化位點的DNA可正常延伸，最終引起結果中高甲基化的極端現(xiàn)象。而且在部分品牌高保真酶的說明書上，雖然沒有強調卻有提示“不宜使用含dUTP或尿嘧啶的模板和引物”。因此，甲基化引物的PCR更注重對Taq酶的擴增能力。相對于普通的TaKaRaTaq，由于EpiTaqTMHS專為修飾DNA設計，其擴增能力得到加強，且在保真性能上不依賴外切酶活性，因此其結果優(yōu)于TaKaRaTaq。

4　結論

（1）17～30 bp短引物使用Touch-down程序PCR效果較好，但無法避免其特異性低的弊端；31～50 bp長引物可解決該問題，并以55℃退火60℃延伸PCR程序擴增，成功率最高，其中反向引物的長度及Tm低于正向引物較佳。

（2）高保真酶因其外切酶活性所致的高甲基化現(xiàn)象，并不適宜用于甲基化研究，而EpiTaqTMHS由于專為修飾模板PCR設計，其有較強的擴增含尿嘧啶模板及不依賴3′→5′外切酶活性的保真能力，在實際應用中效果最佳。

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Primer design and PCR condition optimization for plant site-specific methylation

WANG He-tong1，2，SONG Jie3，CUI Wei-na4，CAO Xia5，6，HE Lei3，JIA Chun-yun1，HUI Xiu-juan1，TAI Pei-dong1，CHENG Zhi-bo1，LIU Wan1*
（1.Key Laboratory of Pollution Ecology and Environmental Engineering，Institute of Applied Ecology，Chinese Academy of Sciences，Shenyang 110016，China；2.Liaoning He University，Shenyang 110163，China；3.Liaoning University，Shenyang 110036，China；4.Shanghai Institute of Technology，Shanghai 201418，China；5.Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；6.Institute of Vegetable Science，Tong Liao Academy of Agricultural Sciences，Tongliao 028000，China）

The present study was to explore design methods for short and long primers in plant methylation research and their corresponding PCR conditions employing large number of designed primers and to analyze the effects on methylation rates using three different Taq polymerases.Results showed：a Touch-down PCR was suitable when using short primers of 17～30 bp，however，low specificity and success rates were observed；PCR performed the best when using long primers of 31～50 bp，provided that length and Tmof forward primers＞those of reverse primers and 55℃and 60℃served as annealing and prolonging temperature，respectively；Super-Fidelity Taq polymerase like Prime STAR Risn′t suitable for methylation research because of its 3′→5′exonuclease activities.However，PCR performed the best when using EpiTaqTMHS.

plant methylation；primer design；Taq polymerase；PCR condition

Q943.2

A

1672-2043（2016）09-1686-08doi：10.11654/jaes.2016-0173

2016－02－02

國家自然科學基金項目（21347007，41272255，41472237）；國家科技重大專項（2012ZX7505-001）

王鶴潼（1985—），男，遼寧沈陽人，博士，從事植物分子毒理及表觀遺傳研究。E-mail：tony.w.china@hotmail.com

劉宛E-mail：liuwan63@hotmail.com