牛糞堆肥中反硝化細(xì)菌與理化參數(shù)的關(guān)系

朱麗平，許修宏，張文浩，成利軍，李洪濤，王紫琪，賀　寧

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

牛糞堆肥中反硝化細(xì)菌與理化參數(shù)的關(guān)系

朱麗平，許修宏*，張文浩，成利軍，李洪濤，王紫琪，賀寧

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

以nosZ基因?yàn)闃?biāo)記，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳法（PCR-DGGE）對牛糞堆肥過程中反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，通過冗余分析（Redundancy analysis，RDA）法，分析反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與堆肥過程中理化參數(shù)（堆體溫度、pH、含水率、氨態(tài)氮和硝態(tài)氮）之間的關(guān)系。結(jié)果表明，反硝化細(xì)菌群落的Shannon-Weaver指數(shù)在堆肥0～4 d升高，在7～29 d減小。對優(yōu)勢條帶進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)Alcaligenes存在于整個(gè)堆肥過程中，判定其為此過程中優(yōu)勢菌屬。反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在堆肥前期（0～4 d）變化較小，而在降溫腐熟期（23～29 d）變化劇烈。皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析表明，反硝化細(xì)菌群落多樣性與含水率呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（r= 0.960，P＜0.01），與溫度呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.766，P＜0.05）。

堆肥；反硝化細(xì)菌；理化參數(shù)；群落結(jié)構(gòu)；冗余分析

朱麗平，許修宏，張文浩，等.牛糞堆肥中反硝化細(xì)菌與理化參數(shù)的關(guān)系［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（9）：1781-1787.

ZHU Li-ping，XU Xiu-hong，ZHANG Wen-hao，et al.Correlationship between denitrifying bacteria and physicochemical factors in cow manure composting［J］. Journal of Agro-Environment Science，2016，35（9）：1781-1787.

近年來，隨著我國農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，大量畜禽糞便和農(nóng)業(yè)秸稈露天放置，對環(huán)境造成了嚴(yán)重污染［1］。目前，采取了多種方式對禽畜糞便和農(nóng)作物秸稈進(jìn)行資源化處理，如將禽畜糞便加工成有機(jī)肥料、將秸稈進(jìn)行飼料化或材料化等［2］，但好氧堆肥法仍然是處理有機(jī)固體廢棄物最有效的方式之一［3］。

在堆肥化過程中，反硝化細(xì)菌能夠?qū)⑾跛猁}轉(zhuǎn)化成氣態(tài)氮（NO、N2O、N2）［4］，不僅會(huì)造成空氣污染，同時(shí)還降低了堆肥品質(zhì)。參與反硝化過程的還原酶主要有4種［5］，其中的nosZ基因催化N2O還原成N2［6］，能夠有效減少溫室氣體的排放，因此，在反硝化過程中，以nosZ基因?yàn)闃?biāo)記，分析反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變化，對研究堆肥過程中氮素轉(zhuǎn)化過程及規(guī)律具有重要的意義。近些年來，雖然在研究堆肥化過程中的反硝化菌方面取得了很大的進(jìn)展［2，7］，但對堆肥過程中理化參數(shù)與反硝化菌群之間關(guān)系的研究尚少。

本研究采用牛糞與稻草秸稈進(jìn)行好氧堆肥實(shí)驗(yàn)，對堆肥過程中溫度（T）、pH、含水率、氨態(tài)氮（NH+4-N）、硝態(tài)氮（-N）等理化參數(shù)進(jìn)行參數(shù)測定。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)（PCRDGGE）來研究以nosZ基因?yàn)闃?biāo)記的反硝化細(xì)菌的群落動(dòng)態(tài)變化，應(yīng)用冗余分析（Redundancyanalysis，RDA）方法研究堆肥過程中反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與理化參數(shù)之間的相關(guān)性，利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)法分析反硝化細(xì)菌群落多樣性與理化參數(shù)的相關(guān)性，并分析影響菌群變化的驅(qū)動(dòng)因子。

1　材料與方法

1.1堆肥實(shí)驗(yàn)與樣品采集

堆肥實(shí)驗(yàn)中的牛糞與水稻秸稈均來自哈爾濱市農(nóng)場，堆肥材料主要成分見表1。將水稻秸稈剪成小段（3～5 cm），便于與牛糞的充分混勻，秸稈與牛糞按照干重比1∶3進(jìn)行充分混合，并且將混合物料的含水率調(diào)節(jié)為60%～65%，置于實(shí)驗(yàn)室自制的堆肥模擬容器中進(jìn)行發(fā)酵，堆肥過程中定期進(jìn)行翻堆，整個(gè)堆肥過程共持續(xù)30 d。

表1　堆肥材料的主要成分Table 1 Properties of raw materials for composting

在堆體的上中下三層的不同位置分別在第0、1、4、7、13、23、29 d取樣并混勻（7個(gè)樣品），以堆肥天數(shù)為樣品標(biāo)號。在堆肥第3、5、11、21 d進(jìn)行翻堆。7個(gè)樣品分為兩部分保存，一部分用于理化參數(shù)的測定，另一部分放于-80℃用于分子實(shí)驗(yàn)分析。

1.2堆肥理化參數(shù)的測定

在堆體上、中、下三層的不同位置，使用精密溫度計(jì)分別測其溫度并取平均值，同時(shí)記錄下室溫。堆體含水率的測定采用恒重法，將7個(gè)堆肥樣品在105℃下烘干24 h，然后進(jìn)行計(jì)算，得出含水率數(shù)值。pH的測定是將每個(gè)堆肥樣品稱取1 g，按1∶10（質(zhì)量濃度）加入去離子水，150 r·min-1下振蕩30 min后在10 000 r·min-1進(jìn)行離心，離心15 min后過濾，濾液用數(shù)字pH儀器測定。NH+4-N含量根據(jù)鮑士旦［8］的農(nóng)化分析方法進(jìn)行測定，-N含量采用酚二磺酸比色法進(jìn)行測定［9］。

1.3DNA提取、純化

用實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的CTAB法對堆肥樣品總DNA進(jìn)行提?。?0］，使用OMEGA純化試劑盒對粗提取的總DNA進(jìn)行回收、純化，檢測純化結(jié)果后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4PCR擴(kuò)增

堆肥過程中反硝化細(xì)菌的檢測以nosZ基因?yàn)闃?biāo)記，選用引物對nosZ-F/nosZ-1622R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且在nosZ-1622R的5′端添加GC夾［11］。PCR擴(kuò)增，體系為50 μL，其中：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 5 μL，模板1 μL，Taq酶0.6 μL，上下游引物各 0.8 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性5 min（95℃）；35個(gè)循環(huán)中再次變性45 s（95℃），退火45 s（61℃），延伸1 min（72℃）；最后再延伸10 min（72℃）［12］，于4℃下保存并停止反應(yīng)。

1.5DGGE及條帶測序

應(yīng)用DcodeTM系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE實(shí)驗(yàn)。使用尿素濃度范圍為35%～70%的8%聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺=37.5∶1，m/V）。電泳條件：在60℃恒溫的1×TAE電泳緩沖液中，120 V恒定電壓下電泳12 h［11］。電泳結(jié)束后，將DGGE膠進(jìn)行染色并拍照。切下主要條帶溶于水后，用不帶GC夾子的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測序。

測序結(jié)果提交至GenBank獲得基因登錄號，用BLAST比對出同源性最高的序列并下載，使用MEGA4.0程序的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6數(shù)據(jù)處理

DGGE圖譜分析采用Quantity One 4.6.2軟件，根據(jù)公式H=-ΣPiln Pi計(jì)算出反硝化細(xì)菌的多樣性指數(shù)（H）；反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與理化參數(shù)的相關(guān)性分析采用Canoco 4.5軟件分析，首先對分析數(shù)據(jù)進(jìn)行除趨勢對應(yīng)分析（Detrended correspondence analysis，DCA），當(dāng)排序軸的梯度長度相對較短時(shí)（＜2），選用冗余分析方法進(jìn)行分析［13］，應(yīng)用Canodraw 4.5程序?qū)⑸傻臄?shù)據(jù)文件進(jìn)行作圖分析［14］；利用SPSS17.0軟件中皮爾遜相關(guān)系數(shù)法分析反硝化細(xì)菌群落多樣性與理化參數(shù)之間的相關(guān)性。

2　結(jié)果與討論

2.1理化參數(shù)的變化

圖1為堆肥過程中溫度變化，根據(jù)堆肥過程中溫度的變化可以將堆肥過程分為三個(gè)階段：0～3 d為升溫期；4～12d為高溫期；13～29d為降溫腐熟期。堆肥開始后溫度逐漸升高，在第5 d時(shí)達(dá)到最高溫57.6℃，并且溫度超過55℃的堆肥時(shí)間持續(xù)了5 d，可在堆肥過程中殺死各種病原菌，滿足基本的堆肥衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［15］。堆體溫度在堆肥第13 d開始迅速下降，且在堆肥后期（13～29 d）溫度變化趨于平穩(wěn)，堆肥過程結(jié)束時(shí)溫度接近于室溫。堆肥過程中溫度的變化與堆體內(nèi)微生物活性息息相關(guān)，二者相互影響，微生物的大量活動(dòng)導(dǎo)致堆體溫度升高，同時(shí)高溫也會(huì)影響微生物體內(nèi)的酶活。所以，溫度既是影響堆肥過程中微生物群落變化的重要因素，也是評價(jià)堆肥是否達(dá)到穩(wěn)定化的重要條件［16］。

圖1　堆肥過程中溫度變化Figure 1 Changes of temperature during composting process

圖2為堆肥過程中含水率與pH的變化。堆肥過程中含水率的變化始終保持在40%～70%的范圍內(nèi)，整體呈現(xiàn)下降的趨勢，在堆肥初期（0 d）堆肥含水率最大，達(dá)到65.7%，隨著堆體溫度升高，含水率逐漸變小，在堆肥結(jié)束時(shí)達(dá)到最低值42.1%。水分不僅直接影響堆體內(nèi)微生物的代謝，而且會(huì)影響堆肥的腐熟速度［15］。堆肥過程中的pH變化在8.06～8.57之間，在堆肥第1 d降至最低值（8.06），第7 d時(shí)達(dá)到最大值（8.57），在堆肥后期（13～29 d）逐漸下降。因?yàn)樵诙逊食跗?，微生物分解大量有機(jī)物的過程中產(chǎn)生有機(jī)酸，使得堆體pH值降低；后期有機(jī)酸的降解及NH+4-N的大量積累使得堆體pH逐漸升高［8］。

圖3為NH+4-N和-N含量變化。NH+4-N含量在堆肥前期（0～4 d）升高而在堆肥后期（7～29 d）呈迅速降低的變化趨勢，其含量從堆肥起始階段（0 d）的767 mg·kg-1迅速增加到第4 d時(shí)的最大值1159 mg· kg-1；隨著堆肥的進(jìn)行，堆體溫度逐漸升高，大量NH3揮發(fā)［17］，從而導(dǎo)致NH+4-N的含量迅速減少（4～29 d），堆肥結(jié)束時(shí)降至最小值453 mg·kg-1。而-N含量在整個(gè)堆肥過程中呈現(xiàn)上升趨勢，在堆肥初期-N含量僅為105 mg·kg-1，可能是由于在初期（0～3 d）某些具有硝化作用的微生物的活性受到了高溫以及NH+4-N大量積累的抑制，致使-N的生成速度減緩［18］。在堆肥4 d以后-N含量迅速增加，堆肥結(jié)束時(shí)達(dá)到425 mg·kg-1。

圖2　堆肥過程中pH和含水率變化Figure 2 Changes of pH and water content during composting process

圖3　堆肥過程中NH+-N和NO--N變化43Figure 3 Changes of NH+-N and NO--N during43composting process

2.2 DGGE圖譜分析

不同時(shí)期的堆肥樣品PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE分離，其結(jié)果如圖4所示。圖中字母代表?xiàng)l帶編號，在7個(gè)泳道上共識別出8條特異性的條帶。堆肥前期（0～7 d）樣品條帶的分布與后期（13～29 d）分布的差異性較大，說明隨著堆肥的進(jìn)行，反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。在堆肥過程中，每個(gè)時(shí)期均有條帶G出現(xiàn)，說明其具有較強(qiáng)的耐受性，為堆肥過程中的優(yōu)勢種群；條帶B、C和F僅在堆肥高溫期出現(xiàn)，是高溫期的特異性條帶，具有較強(qiáng)的耐高溫性。

2.3多樣性分析

不同時(shí)期反硝化細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)應(yīng)用Shannon-Weaver公式進(jìn)行計(jì)算［19］，其結(jié)果如表2所示。反硝化細(xì)菌的多樣性總體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在堆肥開始時(shí)，反硝化細(xì)菌的多樣性指數(shù)呈整個(gè)堆肥過程中的最低值1.803，隨著堆肥的進(jìn)行，反硝化細(xì)菌的多樣性逐漸升高，在高溫期（第4 d）達(dá)到最大值2.536，在堆肥后期多樣性指數(shù)有所下降。這是由于堆肥前期堆體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量相對較為豐富，對反硝化細(xì)菌的生長較為有利；然而，不同菌屬的反硝化細(xì)菌對溫度等理化參數(shù)的敏感程度不盡相同，某些菌屬因適應(yīng)不了高溫或因營養(yǎng)物質(zhì)的減少而被淘汰，使得反硝化細(xì)菌的多樣性呈現(xiàn)高低不同的趨勢［20］。

圖4　堆肥樣品的DGGE圖譜Figure 4 DGGE profile of compost samples

2.4系統(tǒng)發(fā)育分析

要想在實(shí)際工作中實(shí)現(xiàn)對生產(chǎn)規(guī)模的提升，就應(yīng)該進(jìn)行必要的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，只有這樣才能在實(shí)際工作中實(shí)現(xiàn)對農(nóng)產(chǎn)品成本的顯著控制與降低。而要想達(dá)成當(dāng)前的工作目標(biāo)，培育和發(fā)展新型經(jīng)營主體是一項(xiàng)十分重要的環(huán)節(jié)。當(dāng)前很多新型經(jīng)營主體對于這一工作還缺乏必要的認(rèn)識，導(dǎo)致出現(xiàn)了很多問題。

將8個(gè)成功測序的序列結(jié)果提交給Genbank并獲得登錄號：KU246118-KU246125。使用MEGA 4.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹，其結(jié)果如圖5所示。所有的條帶測序結(jié)果與BLAST數(shù)據(jù)庫中比對的序列同源性菌高于55%。在堆肥過程中，條帶G測序結(jié)果與產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）有較高的相似性，在堆肥各個(gè)時(shí)期始終出現(xiàn)，是堆肥過程中的優(yōu)勢菌屬；條帶E和A分別在堆肥初期（1 d）和后期（13 d）被檢測到，經(jīng)測序與副球菌屬（Paracoccus）和固氮螺菌屬（Azospirillum）有較高的相似性；條帶B、C和F僅在高溫期出現(xiàn)，其測序結(jié)果分別與無色桿菌屬（Achromobacter）、未培養(yǎng)細(xì)菌和假單胞菌屬（Pseudomonas）有較高的同源性。

2.5理化參數(shù)與反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

堆肥過程中反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與理化參數(shù)的冗余分析結(jié)果如圖6。前2個(gè)排序軸分別解釋了57.5%和21.1%的反硝化細(xì)菌種群變化，說明這些理化參數(shù)對堆肥過程中反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化有顯著的影響。在RDA二維排序結(jié)果中，帶箭頭的矢量線表示不同的理化參數(shù)，圓圈代表在不同堆肥天數(shù)時(shí)取樣樣品。箭頭的矢量線長度可以表示不同理化參數(shù)與物種之間的相關(guān)性，其矢量線越長，相關(guān)性就越大，反之則越小［21］。從RDA排序圖中可以看出，含水率、硝態(tài)氮和氨態(tài)氮三個(gè)參數(shù)的連線相對較長，說明在堆肥過程中這些因素對反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的影響較大。在RDA分析中，圓圈之間的距離表示菌落結(jié)構(gòu)的差異性，圓圈間連線越短，差異性越?。?3］。由此可知，反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)在堆肥前期（0～4 d）變化較小。在降溫腐熟期（23～29 d）變化則較為劇烈。

表2　反硝化細(xì)菌的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity index of denitrifying bacteria

圖5　反硝化細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 5 Phylogenetic tree of denitrifying bacteria

圖6　反硝化細(xì)菌種群變化與理化參數(shù)的RDA圖Figure 6 RDA of denitrifying bacteria community and physic-chemical parameters

堆肥過程中理化參數(shù)（含水率、硝態(tài)氮和氨態(tài)氮）對反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化有不同程度的影響。含水率與堆肥中溶解氧的濃度密切相關(guān)，當(dāng)含水率較大時(shí)，堆體中溶解氧濃度較低［22］，利于反硝化菌的生長，因?yàn)槎鄶?shù)反硝化菌屬厭氧微生物。在堆肥初始階段（0～3 d），堆體含水率較大，在一定程度上使得堆體內(nèi)成厭氧或缺氧的狀態(tài)，因而反硝化菌的生長較為穩(wěn)定，其群落結(jié)構(gòu)變化較小；在堆肥后期（4～29 d），含水率降低使得溶氧量相對較高，使得堆體內(nèi)的反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化。

過去的研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，硝態(tài)氮含量可以影響反硝化速率與菌群的群落結(jié)構(gòu)變化［23］。在本文中，硝態(tài)氮與反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定的相關(guān)性，也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，反硝化細(xì)菌的變化與硝態(tài)氮濃度并無顯著的相關(guān)性［24］。這些結(jié)果表明，在不同的環(huán)境條件下，硝態(tài)氮濃度對反硝化細(xì)菌群落變化的影響存在顯著性的差異。堆肥的前期（0～4 d），堆肥中反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變化較小，在此階段中，供反硝化細(xì)菌作用的營養(yǎng)物質(zhì)相對較多，反硝化細(xì)菌作用時(shí)相對穩(wěn)定，所以，群落結(jié)構(gòu)變化不大，其硝態(tài)氮含量逐漸積累增加；但在堆肥后期（23～29 d），反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化卻很大，其原因可能是因?yàn)槎逊屎笃跔I養(yǎng)物質(zhì)的減少以及大量硝態(tài)氮的積累，對反硝化細(xì)菌的作用產(chǎn)生了一定程度的影響。所以，反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與理化因子之間的關(guān)系還需更多的研究。氨態(tài)氮表面上雖然與反硝化細(xì)菌的作用并無直接聯(lián)系，但在氨態(tài)氮氧化生成硝態(tài)氮的過程中，會(huì)產(chǎn)生大量N2O氣體，此氣體作為反硝化功能基因（nosZ）的底物，其含量多少會(huì)對反硝化細(xì)菌的作用產(chǎn)生影響。胡春曉等［25］也在對農(nóng)業(yè)廢棄物好氧堆肥過程的研究中發(fā)現(xiàn)，氨態(tài)氮濃度與nosZ基因呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

反硝化細(xì)菌的變化，不僅體現(xiàn)在其群落結(jié)構(gòu)與理化參數(shù)的相關(guān)性，還有反硝化細(xì)菌群落多樣性與理化參數(shù)之間的相關(guān)性。理化參數(shù)與反硝化細(xì)菌群落多樣性的皮爾遜相關(guān)性分析結(jié)果如表3所示。堆肥過程中反硝化細(xì)菌群落多樣性與含水率呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.960，P＜0.01），說明隨著含水率的變大，反硝化細(xì)菌的群落多樣性呈現(xiàn)顯著性的增加，反之則減少；溫度與反硝化細(xì)菌群落多樣性呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r= 0.766，P＜0.05），說明隨著溫度的增加，反硝化細(xì)菌多樣性也增加，反之則呈下降的趨勢。但溫度卻不是影響反硝化細(xì)菌多樣性的最主要因素，溫度的變化通過對溶氧量及含水率等因素的影響，從而對反硝化細(xì)菌的多樣性有一定程度的影響［26-28］。含水率對反硝化細(xì)菌群落多樣性的影響呈現(xiàn)了極顯著的相關(guān)性，說明反硝化細(xì)菌群落多樣性對堆體內(nèi)含水率的大小敏感程度很大，其細(xì)微的變化就能引起多樣性的改變。

表3　理化參數(shù)與反硝化細(xì)菌群落多樣性的皮爾遜相關(guān)分析Table 3 Pearson correlations between physic-chemical parameters and diversity index of denitrifying bacteria

溫度也可以對其他理化參數(shù)產(chǎn)生影響，從而間接地影響微生物的代謝活動(dòng)。在堆肥過程中，溫度的變化使得堆體內(nèi)含水率有所不同，其含水率的大小與溶氧濃度存在著一定的相關(guān)性。堆體內(nèi)含水率較大時(shí)，溶氧濃度相對較低，反之溶氧量含量較高［29］。有大量的研究表明，當(dāng)溶解氧濃度在一定的范圍內(nèi)時(shí)，反硝化細(xì)菌的活性不會(huì)受到溶解氧濃度的影響［30］；當(dāng)溶解氧的濃度低于某個(gè)值的時(shí)候，反硝化細(xì)菌的活性隨著溶解氧濃度的降低而升高。這就說明影響反硝化細(xì)菌活性的溶解氧濃度存在著一個(gè)極限值，也稱為閾值［31］。堆肥過程溶氧的變化可能受堆肥水分的影響，因此堆肥過程中反硝化細(xì)菌群落多樣性隨含水率的變大而升高。

3　結(jié)論

（1）在牛糞堆肥過程中，反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在堆肥前期（0～4 d）變化較小，在堆肥后期（23～29 d）變化較為劇烈；反硝化細(xì)菌群落多樣性總體呈現(xiàn)先升高（0～4 d）后降低的趨勢（23～29 d）；

（2）Alcaligenes（條帶G）存在于整個(gè)堆肥過程中，有較強(qiáng)的耐受性，是堆肥過程中反硝化細(xì)菌的優(yōu)勢種屬；Achromobacter（條帶B）、未培養(yǎng)細(xì)菌（條帶C）和Pseudomonas（條帶F）僅出現(xiàn)在堆肥高溫期，具有較強(qiáng)的耐高溫性，是高溫階段的優(yōu)勢性菌屬。

（3）堆體含水率、硝態(tài)氮和氨態(tài)氮對群落結(jié)構(gòu)變化有著不同程度的影響。含水率與反硝化細(xì)菌群落多樣性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，溫度與反硝化細(xì)菌群落多樣性呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

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Correlationship between denitrifying bacteria and physicochemical factors in cow manure composting

ZHU Li-ping，XU Xiu-hong*，ZHANG Wen-hao，CHENG Li-jun，LI Hong-tao，WANG Zi-qi，HE Ning
（School of Resources and Environmental Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

In the present paper，the community structure of denitrifying bacteria during cow manure composting process was analyzed by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis（PCR-DGGE）based on the nosZ gene.The relationship between the changesofdenitrifyingbacteria community structure and the physic-chemical parameters（temperature，pH，water content was evaluated by redundancy analysis（RDA）.Results showed that the Shannon-Weaver index of denitrifying bacteria increased during 0～4 d but decreased during 7～29 d of the composting.Based on the sequencing of dominant bands，Alcaligenes were the dominant species during composting.Redundancy analysis（RDA）showed that the community structure of dinitrifying bacteria changed little at the early stage of composting（0～4 d），while it changed dramatically in the maturity stage of composting（23～29 d）.Pearson correlation analysis showed that denitrifying bacteria community diversity was extremely significantly positively correlated with water content（r=0.960，P≤0.01），and significantly positively correlated with temperature（r=0.766，P≤0.05）.

compost；denitrifier；physico-chemical parameter；bacterial community structure；redundancy analysis

X713

A

1672-2043（2016）09-1781-07doi：10.11654/jaes.2016-0250

2016-03-01

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272484，31372351）

朱麗平（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)槲⑸?。E-mail：502348499@qq.com

許修宏E-mail：xuxiuhong@neau.edu.cn