紅藻氨酸致癲癇大鼠血清和腦脊液中S100B、CRP的動態(tài)變化

俸軍林，魯建華，蔣靜子，唐永剛，林小慧

(1桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541001;2咸陽市中心醫(yī)院)

膠質(zhì)細胞損傷和炎癥反應與癲癇的關(guān)系日益受到重視。目前關(guān)于S100B、C反應蛋白(CRP)與癲癇發(fā)作的研究不多。S100B蛋白被認為是腦內(nèi)特異蛋白，是反映腦細胞損傷的早期指標［1］。CRP是一種敏感的急性時相蛋白，可以快速反映炎癥變化，被譽為炎癥標志物。2009年8～12月，我們采用立體定向技術(shù)行紅藻氨酸(KA)側(cè)腦室注射建立大鼠癲癇動物模型，通過檢測大鼠癲癇發(fā)作后不同時間點血清和腦脊液中S100B、CRP水平動態(tài)變化并觀察其相互關(guān)系，以探討S100B、CRP與癲癇及其所致腦損傷之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康清潔級SD大鼠48只，體質(zhì)量250～300 g，廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供。飼養(yǎng)條件:溫暖(20℃)，避強光、避噪音，單籠，自由進食和飲水。按照完全隨機數(shù)字表法將實驗動物分成模型組(40只)和對照組(8只)，模型組再按照不同處死時間分為造模后6 h、12 h、24 h、72 h和1周共5組，每組8只。

1.2 癲癇動物模型制備 以3.6%水合氯醛360 mg/kg腹腔注射將大鼠麻醉后，將其頭部固定在立體定向儀上，常規(guī)備皮、消毒，沿頭部正中線切開頭皮、暴露前囟。根據(jù)大鼠腦立體定向圖譜定位側(cè)腦室(前囟后0.8 mm，右側(cè)旁開 1.5 mm)，鉆直徑為1.0 mm的一個圓孔，深度達硬腦膜表面，注意盡量不傷及腦組織。將預先裝有KA的微量進樣器沿鉆孔進針，深度達4.7 mm時向側(cè)腦室內(nèi)緩慢注射1 μg/μl KA 溶液1 μl(10 min 內(nèi)勻速注射完畢)，留針5 min后拔除穿刺針，用骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮，放回籠中進行行為學觀察。按照Racine分級［2］判斷癲癇發(fā)作程度，Ⅲ級以上為成功動物模型。如果造模失敗，則用相同數(shù)量動物補充造模。對照組用等體積生理鹽水代替KA行側(cè)腦室注射。

1.3 血清及腦脊液標本采集 模型組大鼠在KA側(cè)腦室注射致癇后6 h、12 h、24 h、72 h和1周分別采集血液和腦脊液。對照組大鼠注射生理鹽水24 h后采集血和腦脊液。腦脊液采用經(jīng)枕大孔直接穿刺法采集:先將大鼠頭部固定在腦立體定向儀上，暴露寰枕筋膜，用微量進樣器自大鼠枕外嵴下0.3 cm處朝向小腦延髓池方向進針抽取腦脊液，進針深度不超過0.3 cm，用無菌管收集腦脊液。然后暴露心臟，每只大鼠采心臟血2.5 ml。所有標本在室溫下以3000 r/min離心20 min，取上清液置-20℃冰箱內(nèi)保存待測。

1.4 S100B、CRP含量檢測 采用ELISA法檢測血清及腦脊液中S100B、CRP含量，試劑盒購自美國R＆D公司。雙抗體夾心法測定大鼠血清和腦脊液中S100B、CRP水平，按照試劑盒說明書的步驟進行規(guī)范操作。以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線并計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料以表示，依據(jù)實驗數(shù)據(jù)類型作方差分析和相關(guān)分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學觀察結(jié)果 模型組大鼠在KA側(cè)腦室注射后20～30 min即表現(xiàn)凝視、點頭和濕狗樣抖動，持續(xù)約30 min，1～3 h后出現(xiàn)反復發(fā)作的咀嚼、面部抽搐、肢體陣攣、身體背曲、尾部翹起、陣發(fā)性旋轉(zhuǎn)、站立跌倒、后退等癲癇發(fā)作癥狀。每次發(fā)作數(shù)秒至10余秒，反復間歇性發(fā)作數(shù)小時，8 h后逐漸恢復到正常狀態(tài)，24 h～1周出現(xiàn)自發(fā)性發(fā)作，以Ⅱ～Ⅲ級發(fā)作為主。對照組大鼠無上述癇樣發(fā)作。

2.2 癲癇發(fā)作后各時間點血清和腦脊液S100B及CRP的動態(tài)變化 見表1。

表1 癲癇大鼠血清和腦脊液S100B、CRP含量比較()

表1 癲癇大鼠血清和腦脊液S100B、CRP含量比較()

注:與對照組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 n S100B(μg/L)血清 腦脊液CRP(mg/L)血清 腦脊液6 h組8 0.21 ±0.05 0.33 ±0.05 5.82 ±0.93 6.61 ±1.0112 h 組 8 0.27 ±0.02* 0.40 ±0.05△ 8.41 ±1.40△ 10.15 ±1.34△24 h 組 8 0.54 ±0.07△ 0.72 ±0.02△ 10.01 ±1.80△ 13.31 ±1.78△72 h 組 8 0.25 ±0.05 0.33 ±0.03 6.20 ±1.19* 6.95 ±0.36*1 周組 8 0.23 ±0.05 0.31 ±0.05 4.77 ±0.94 5.97 ±0.90對照組8 0.20 ±0.03 0.29 ±0.05 4.39 ±0.92 5.28 ±0.96

2.3 S100B與CRP的相關(guān)性分析 模型組大鼠血清中S100B 與CRP 呈正相關(guān)(r=0.788，P ＜0.01);腦脊液中CRP與S100B也呈正相關(guān)(r=0.873，P＜0.01)。

3 討論

S100B是S100家族中在腦內(nèi)最具有活性的成員，主要存在于神經(jīng)膠質(zhì)細胞，被認為是神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標記蛋白。膠質(zhì)細胞覆蓋了毛細血管表面積的85%，是血腦屏障的重要組成部分，在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞穩(wěn)定性和血腦屏障滲透性之間的平衡中發(fā)揮重要作用，并可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活動［3］。正常大腦由于完整的血腦屏障結(jié)構(gòu)使S100B蛋白只出現(xiàn)在腦脊液，血清中含量較低。當神經(jīng)系統(tǒng)疾病影響到血腦屏障的結(jié)構(gòu)與功能時，結(jié)構(gòu)受損的神經(jīng)膠質(zhì)細胞可釋放S100B蛋白進入腦脊液，進而通過血腦屏障進入血液循環(huán)［4］。其機制有:①腦損傷后，S100B進入細胞間質(zhì)，再經(jīng)過受損的血腦屏障進入血液循環(huán);②S100B從細胞液中滲出進入腦脊液，再經(jīng)受損的血腦屏障進入血液［5］。Marchi等［6］提出 S100B 蛋白可作為反映血腦屏障損傷的外周生化標志物的理論。但是，關(guān)于S100B與癲癇相關(guān)性的研究目前尚無定論［7］。本實驗結(jié)果顯示，血清和腦脊液中S100B水平在KA側(cè)腦室注射致癇后早期即開始升高，24 h達高峰，以后逐漸減低，1周后逐漸降至正常水平。結(jié)合前述文獻資料，說明癲癇發(fā)作后早期即存在血腦屏障破壞和星形膠質(zhì)細胞受損，血清和腦脊液中S100B蛋白可作為反映癲癇所致腦損傷早期的生化指標。

CRP在炎性反應或組織損傷發(fā)生后6～8 h開始升高，24～48 h可達峰值，被譽為炎癥標志物［8］。炎癥與癲癇的關(guān)系近幾年來受到較大關(guān)注，在各種不同形式及病因的癲癇中，炎癥反應可能參與癲癇發(fā)生及其神經(jīng)元死亡［9］，而膠質(zhì)細胞的激活和細胞因子的上調(diào)導致海馬病理改變，如神經(jīng)元死亡及反應性膠質(zhì)增生［10］。Peltola 等［11］在強直—陣攣性發(fā)作后的癲癇患者中檢測到CRP濃度升高，李洪亮等研究顯示，癲癇患者發(fā)作后血清CRP含量于發(fā)作后24 h內(nèi)明顯增高，之后隨時間的推移逐漸下降。本實驗結(jié)果顯示，血清和腦脊液中CRP含量在KA致癇后6 h即開始升高，24 h達峰值，同時，大鼠血清、腦脊液中的CRP與S100B均呈正相關(guān)，進一步證明炎癥反應可能參與了癲癇發(fā)生及其所致的腦損傷。正常情況下CRP僅微量存在于血清及腦脊液中，癲癇后血清和腦脊液中的CRP水平增高可能與膠質(zhì)的活化以及血腦屏障的破壞有關(guān)，其機理可能是因為與炎癥相關(guān)聯(lián)的細胞因子多由膠質(zhì)細胞分泌產(chǎn)生。正常情況下，腦組織不表達或低水平表達細胞因子，而KA致腦組織興奮性毒性損傷后，活化的膠質(zhì)細胞在產(chǎn)生和釋放蛋白標志物的同時可分泌大量的細胞因子，并進一步通過受損的血腦屏障進入血液中，從而引起血清和腦脊液中的CRP水平增高。

綜上所述，KA致癇大鼠血清、腦脊液中的S100B與CRP水平呈現(xiàn)顯著的動態(tài)改變，提示致癇大鼠腦內(nèi)存在動態(tài)的急性炎癥反應，這種炎癥反應可能參與癲癇發(fā)生及癲癇所致的腦損傷。有關(guān)炎癥反應與癲癇的病理機制，以及血清和腦脊液中S100B、CRP的臨床應用價值尚有待進一步研究。

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