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    大分子擁擠體系下葡聚糖對SPI的共價修飾*

    2011-08-02 05:52:00齊軍茹卓秀英楊曉泉尹壽偉黃立新
    關(guān)鍵詞:大分子葡聚糖接枝

    齊軍茹 卓秀英 楊曉泉 尹壽偉 黃立新

    (華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州510640)

    “大分子擁擠”是生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點[1],生命細胞內(nèi)含有大量的大分子物質(zhì)如多糖、蛋白質(zhì)、核酸等,這些大分子以很高的濃度存在,使細胞內(nèi)環(huán)境變得異常擁擠,大多數(shù)的生化反應(yīng)是在這種擁擠的環(huán)境體系中完成的.因此,近幾年生命科學(xué)家強烈建議把“大分子擁擠”環(huán)境與pH、離子強度和溶液組成等常規(guī)因素一樣用于研究生物大分子,加入擁擠物質(zhì)逐漸成為一種研究大分子的途徑[2].

    蛋白質(zhì)和多糖是共存于食品乳化體系中的最重要的兩類生物大分子,是影響食品結(jié)構(gòu)和功能的主要因素.蛋白質(zhì)因能在液—液或氣—液界面上形成吸附層,降低界面張力,多在膠體體系中充當(dāng)乳化劑;多糖則由于其良好的增稠性和持水性而常用作穩(wěn)定劑.與以次級力結(jié)合的蛋白質(zhì)-多糖體系相比,共價鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)與多糖形成大分子復(fù)合物,既保留了蛋白質(zhì)的表面活性又具有多糖的親水性能,具有較高的環(huán)境適應(yīng)性,其結(jié)合不受熱或pH值的影響[3].就乳化性能而言,大分子復(fù)合物優(yōu)于某些商業(yè)小分子乳化劑[4-5];引入糖鏈后,蛋白質(zhì)的溶解度、抗氧化性、抗菌性以及熱穩(wěn)定性等性能提高[5-6].

    當(dāng)體系中存在高濃度的生物大分子時,大分子之間的反應(yīng)遵循分子排斥容積理論[7],促進反應(yīng)向溶質(zhì)總體積減小的方向,即朝結(jié)合方向移動[8];此外,大分子擁擠環(huán)境下蛋白質(zhì)分子構(gòu)型趨于穩(wěn)定,蛋白質(zhì)變性程度以及聚集程度將會減小[9].筆者前期研究了乙醇體系中大豆分離蛋白-葡聚糖共價復(fù)合物的制備及機理,結(jié)果表明乙醇通過控制水分活度對Maillard反應(yīng)有促進作用[10].基于大分子擁擠理論,文中將多糖(葡聚糖)和蛋白質(zhì)(大豆分離蛋白)作為生物大分子形成高濃度的大分子擁擠環(huán)境,進行Maillard反應(yīng),探討了葡聚糖對大豆分離蛋白的共價修飾作用;與乙醇體系不同,大豆分離蛋白和葡聚糖不僅僅是反應(yīng)試劑,而且是擁擠試劑.

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    主要材料與試劑如下:實驗用大豆低溫脫脂豆粕,購自山東東營蛋白廠;葡聚糖(相對分子質(zhì)量為60000~90000),購自Sigma公司;無水乙醇和甲醇等試劑均為國產(chǎn)分析純.

    1.2 儀器和設(shè)備

    主要儀器和設(shè)備如下:Q100型差示掃描量熱儀,美國TA Instruments公司生產(chǎn);1525型凝膠滲透色譜儀,美國Waters公司生產(chǎn);MOS 450型圓二色光譜儀,法國BIO-LOGIC公司生產(chǎn);Mastersizer 2000型粒度分布儀,英國Malvern Instruments公司生產(chǎn).

    1.3 實驗方法

    1.3.1 大豆分離蛋白的制備

    大豆分離蛋白(SPI)的制備方法見文獻[10].

    1.3.2 蛋白 -多糖干熱反應(yīng)

    將大豆分離蛋白與葡聚糖按質(zhì)量比1∶1混合并溶解,調(diào)混合物總質(zhì)量濃度至60 g/L,冷凍干燥.物料過120目篩后放置在有飽和KBr溶液的容器內(nèi),保持相對濕度為79%,在60℃下恒溫反應(yīng)5d,得到干熱復(fù)合物(DHC).

    1.3.3 SPI和葡聚糖的交聯(lián)

    分別稱取1g大豆分離蛋白和一定量的葡聚糖,加入pH值為6.5的磷酸鹽緩沖液10 mL,攪拌2 h至完全溶解,添加0.2%NaN3數(shù)滴,置于5℃過夜;之后保持恒溫,攪拌加熱一段時間后,4℃下透析24h,于20℃在10000g離心30 min,取上清液,冷凍干燥,得到大豆分離蛋白-葡聚糖共價復(fù)合物(SDC).

    1.3.4 接枝度的測定

    采用鄰苯二甲醛(OPA)法[11]測定接枝度.稱取40mg的 OPA溶解于1 mL的甲醇中,分別加入2.5mL 200g/L的十二烷基磺酸鈉(SDS)、25 mL 0.1mol/L 的硼砂、100μLβ-巰基乙醇,最后用蒸餾水定容至50 mL,得到OPA試劑.取OPA試劑4 mL于試管中,分別注入200 μL樣品液,混勻后于35℃反應(yīng)2min,340nm下測其吸光值.由此可得接枝度G:

    式中,D0為接枝反應(yīng)前溶液的吸光值,D1為接枝反應(yīng)后溶液的吸光值.

    1.3.5 乳化活性的測定

    樣品用去離子水配制成2%(質(zhì)量分數(shù))的溶液,加入含量為20%(體積分數(shù))的花生油溶液,30MPa高壓均質(zhì)2次,制成乳狀液,用去離子水按質(zhì)量比1∶1000稀釋,采用粒度分布儀測定乳狀液中粒子大小及其分布[12].參數(shù)設(shè)置如下:顆粒折射率為1.520,分散劑折射率為1.330.

    1.3.6 熒光光譜分析

    采用1-苯胺基萘-8-磺酸鹽(ANS)熒光探針法[13]進行分析.將加熱后的糖基化產(chǎn)品用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)稀釋為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.1 g/L的待測樣,檢測前取20 μL ANS溶液(8mmol/L)加到4mL待測液中混合均勻,激發(fā)波長為390nm(狹縫5 nm),迅速進行400~600 nm的波長掃描.

    1.3.7 其它分析方法

    SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、熱穩(wěn)定性測定、凝膠滲透色譜分析及圓二色光譜儀分析的具體方法參考文獻[10].

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Maillard反應(yīng)條件的確定

    Maillard反應(yīng)中,蛋白質(zhì)中的游離氨基對側(cè)鏈進行修飾,文中通過游離氨基的變化情況表征Maillard反應(yīng)的程度,即接枝度.

    在反應(yīng)體系中,蛋白質(zhì)分子有一個肽鏈展開、游離氨基暴露的過程,隨著反應(yīng)的進行,游離氨基參與了羰氨反應(yīng),形成共價結(jié)合物,體系游離氨基逐漸減少,接枝度升高.當(dāng)SPI/葡聚糖質(zhì)量比為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 時,對應(yīng)的接枝度分別為 20.21%、62.72%、63.19%、44.65%,接枝度隨葡聚糖濃度的升高先升高后降低.這是因為:體系越擁擠,與SPI的接觸面越大,有利于反應(yīng)的進行,接枝度增大,但是同時葡聚糖的空間位阻也增加,會阻礙共價交聯(lián)的進行,過大的葡聚糖濃度會使接枝度減小.可見,SPI/葡聚糖的最佳質(zhì)量比為1∶1(質(zhì)量比為1∶2時所耗葡聚糖過多).當(dāng)反應(yīng)時間為 18、24、30、36 h時,對應(yīng)的接枝度分別為44.79%、56.48%、62.70%、62.91%,可見,反應(yīng)時間增加,接枝度提高,當(dāng)反應(yīng)時間達到30 h時,其接枝度與36 h時基本相當(dāng).在Maillard反應(yīng)中,當(dāng)反應(yīng)溫度為 50、55、60、65℃時,對應(yīng)的接枝度分別為30.73%、49.92%、62.84%、62.99%,可見,隨著反應(yīng)溫度的升高,接枝度提高,當(dāng)反應(yīng)溫度從60℃升高到65℃時,接枝度增加不明顯.因此,可確定Maillard反應(yīng)的適宜條件為:SPI/葡聚糖質(zhì)量比為1∶1,反應(yīng)時間為30h,反應(yīng)溫度為60℃.

    2.2 電泳圖譜分析

    圖1為考馬斯亮藍染色和糖蛋白染色的電泳圖譜.在考馬斯亮藍染色圖譜中,SDC的條帶中分離膠與濃縮膠界面有相對分子質(zhì)量較大且集中的物質(zhì)生成,在上樣孔與濃縮膠界面生成了相對分子質(zhì)量更大的聚集物,有大量難以進入濃縮膠的大分子物質(zhì),而未加熱和加熱的SPI條帶沒有這兩種現(xiàn)象.在糖蛋白染色圖譜中,對應(yīng)考馬斯亮藍染色圖譜中的大分子區(qū)域均有聚合產(chǎn)物條帶,表明SDC為共價結(jié)合的糖蛋白.

    圖1 考馬斯亮藍染色和糖蛋白染色的電泳圖譜Fig.1 Electrophoretograms with coomassie brilliant blue staining and carbohydrate staining

    結(jié)合接枝度分析的結(jié)果可知,模擬大分子擁擠體系可以大大縮短反應(yīng)時間,擁擠體系只需30 h就可完成反應(yīng),而傳統(tǒng)的干熱反應(yīng)需5天.這是因為水相反應(yīng)中可以自由攪拌,克服了干熱反應(yīng)不均勻的缺點,最大程度地讓多糖和蛋白質(zhì)充分接觸,從而加快了反應(yīng)速度.這說明了模擬大分子擁擠體系進行Maillard反應(yīng)的可行性和有效性.

    2.3 乳化活性

    圖2示出了各樣品的乳化活性.乳狀液中的粒度分布是影響乳狀液穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素,也是評價樣品乳化活性的重要指標(biāo).乳狀液粒子越大,乳析過程越快,乳析率越高.由圖2可知:SDC的乳液粒徑小,乳化活性高,且穩(wěn)定性好;質(zhì)量比為1∶1的SPI/葡聚糖混合物的乳液粒徑偏高,表明未經(jīng)Maillard反應(yīng)的混合物中蛋白質(zhì)的乳化活性沒有得到改善;SPI單獨加熱所得產(chǎn)物的乳液粒徑明顯較大,說明在加熱過程中蛋白質(zhì)發(fā)生了熱聚集,從而導(dǎo)致粒徑增大,乳化活性降低.顯然,大分子擁擠環(huán)境中,葡聚糖糖鏈的鍵入可有效抑制蛋白質(zhì)的熱聚集.該現(xiàn)象表明,大分子擁擠體系中Maillard反應(yīng)制備的蛋白

    圖2 乳化活性的比較Fig.2 Comparison of emulsifying activity

    2.4 疏水性分析

    圖3為產(chǎn)物加熱后的外置熒光光譜.利用ANS作為熒光探針的外置熒光光譜可以分析蛋白質(zhì)疏水基團暴露的情況.ANS連接到芳香族氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的支鏈上,因而熒光強度與蛋白質(zhì)的疏水性直接相關(guān)[14],熒光強度越大,疏水性越強.由圖 3可知,熒光強度的高低順序為:SPI>SPI/葡聚糖混合物>SDC.這說明以共價鍵形式鍵入的葡聚糖能夠與芳香族氨基酸共價結(jié)合,減少蛋白質(zhì)表面的疏水基團,降低由于疏水作用導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集.

    圖3 對照樣品和SDC的外置熒光光譜Fig.3 Exterior fluorescence emission spectra of control samples and SDC

    2.5 熱穩(wěn)定性分析

    圖4為SDC和SPI的差示掃描量熱(DSC)圖譜.加熱是蛋白質(zhì)加工中不可避免的工序,而蛋白在熱作用后會發(fā)生變化(如聚集、分子結(jié)構(gòu)變化等),因而影響其功能.由圖4可知,三者均呈現(xiàn)了一至兩個吸收峰,這是SDC和SPI的熱變性峰.其中SDC的變性溫度較高,為105.17℃,變性焓為25.600J/g,兩項指標(biāo)都高于加熱和未加熱處理的SPI,表明大分子擁擠體系中,蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性提高了.原因可能是由于葡聚糖分子糖鏈的鍵入,分子的凈負電荷增加,空間位阻增大,靜電排斥作用增強[15],因此接枝的復(fù)合物在熱作用下不易發(fā)生聚集[16],熱穩(wěn)定性得到提高.

    圖4 SDC和SPI的DSC圖譜Fig.4 DSC profiles of SDC and SPI

    2.6 相對分子質(zhì)量分析

    圖5為對照樣品和SDC的凝膠滲透色譜圖,根據(jù)所測標(biāo)準(zhǔn)樣品的數(shù)據(jù),當(dāng)洗脫時間為12.97 min時,對應(yīng)的相對分子質(zhì)量為669000;當(dāng)洗脫時間為15.83min時,對應(yīng)的相對分子質(zhì)量為158000;當(dāng)洗脫時間為17.06 min時,對應(yīng)的相對分子質(zhì)量為43000.比較可知,與SPI相比,SDC的吸收峰發(fā)生明顯變化,且洗脫峰位置前移,說明生成了聚合物;相對分子質(zhì)量變大,說明糖基化處理后,大分子的分散度提高,蛋白與糖交聯(lián)后其產(chǎn)物為各種不同相對分子質(zhì)量的物質(zhì)組成的混合物,其中高相對分子質(zhì)量的物質(zhì)較多,與2.2節(jié)中的電泳圖譜分析結(jié)果一致.

    圖5 對照樣品和SDC的凝膠滲透色譜Fig.5 Gel permeation chromatograms of control samples and SDC

    2.7 蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)分析

    圖6(a)示出了對照樣品和SDC二級結(jié)構(gòu)的變化情況.研究表明,典型的α螺旋結(jié)構(gòu)蛋白在192nm處有明顯正吸收峰,在208nm及222nm處有兩個明顯負吸收峰,β折疊結(jié)構(gòu)在196 nm處有一正的譜帶,在206 nm處有一負的譜帶[17].與SPI的二級結(jié)構(gòu)組成相比,兩種糖基化產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)與SPI一樣,仍以β折疊結(jié)構(gòu)為主,而α螺旋含量均有不同幅度的減少,無規(guī)則卷曲含量都增加.這說明蛋白質(zhì)肽鏈中引入較長的糖鏈,抑制了蛋白質(zhì)分子聚集,空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,柔韌性有所增加[18].與干熱產(chǎn)物DHC的二級結(jié)構(gòu)略有不同,SDC的α螺旋結(jié)構(gòu)減少的幅度較大,原因可能是水溶液更有利于反應(yīng)的進行,反應(yīng)程度更高,隨著葡聚糖分子的接入,空間位阻增大,α螺旋結(jié)構(gòu)迅速減少,蛋白質(zhì)展開逐漸趨于穩(wěn)定.

    圖6 對照樣品和SDC的圓二色譜分析Fig.6 Circular dichroism spectra of control samples and SDC

    對照樣品和SDC三級結(jié)構(gòu)的近紫外圖譜如圖6(b)所示.圓二色譜的近紫外圖譜反映了蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團的變化,主要是芳香族氨基酸,如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)[19].圖6(b)中SDC圖譜變化大,曲線主要波動出現(xiàn)在250~290nm內(nèi),表明擾動主要發(fā)生在Phe、Tyr殘基及二硫鍵附近.糖鏈的接入能引進較大的空間位阻,較大程度地屏蔽掉近紫外區(qū)有信號的芳香族氨基的圓二信號,尤其在Phe的特征信號范圍250~265 nm內(nèi),圓二信號負值增強,說明在糖基化過程中苯丙氨酸減少,可能與葡聚糖發(fā)生了共價交聯(lián).結(jié)合近紫外和遠紫外圓二色譜分析可知,糖基化產(chǎn)物的二、三級結(jié)構(gòu)都發(fā)生了明顯的變化,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的柔韌性有所增強,這將更有利于發(fā)揮其功能.

    3 結(jié)語

    文中探討了大分子擁擠體系中蛋白質(zhì)糖基化的有效性,發(fā)現(xiàn)大分子擁擠體系可加速接枝反應(yīng)的進程,大大縮短反應(yīng)時間.電泳圖譜結(jié)果表明,接枝效果良好,所得產(chǎn)物具有優(yōu)異的性能,特別是乳化活性和熱穩(wěn)定性.此外,文中還從構(gòu)象角度揭示了大分子擁擠體系中蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)物的特性:反應(yīng)體系中蛋白二級結(jié)構(gòu)α螺旋含量減少,無規(guī)則卷曲含量增強,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的柔韌性增強,更有利于發(fā)揮其功能.SDC作為一種性能優(yōu)異的的大分子復(fù)合物在食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用,文中提供的SDC制備方法可為工業(yè)生產(chǎn)提供一定的技術(shù)基礎(chǔ),有助于SDC的工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn).

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