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    mRSD-9基因參與細(xì)胞內(nèi)吞功能的初步研究*

    2011-08-02 07:38:50李樹春王桂萍滿序聰
    中國病理生理雜志 2011年10期
    關(guān)鍵詞:基序結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒

    李樹春, 王 槐, 王桂萍, 滿序聰

    (中央民族大學(xué),中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院,北京 100081)

    Endophilin 3是一種包含BAR結(jié)構(gòu)域的蛋白,它參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)[1]。我們實(shí)驗(yàn)室以endophilin3的N端保守區(qū)+可變區(qū)(C+V區(qū))為誘餌,應(yīng)用酵母雙雜交的方法從小鼠睪丸cDNA文庫中篩選獲得了一個(gè)編碼結(jié)合蛋白的新基因,命名為mRSD-9。該基因全長為575 bp,開放讀碼框534 bp,編碼一個(gè)含177個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),獲得Gen-Bank接受號(hào)為AY278322。本實(shí)驗(yàn)對(duì)mRSD-9蛋白和endophilin 3的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證,并對(duì)該基因功能進(jìn)行初步研究。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 菌株 E.coli DH5,用于質(zhì)粒的擴(kuò)增與轉(zhuǎn)化?;蛐?F-φ80dlacZΔM15 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rk-mk+)supE44 relA1 deoRΔ(lacZYA -argF)U169購自天根生化科技有限公司。

    1.2 細(xì)胞株 CHO細(xì)胞系是本室保存,293T細(xì)胞系購自ATCC。

    1.3 質(zhì)粒載體 pGEM-T載體:用于PCR產(chǎn)物的克隆(Promega);pEGFP-N1:用于基因的真核表達(dá)(BD Biosciences);pDsRed1-N1:用于基因的真核表達(dá)(BD Biosciences);pcDNA6/V5-HisB-FLAG/HA/Myc(Invitrogen):用于基因的真核表達(dá)。

    1.4 抗體 Endophilin 3和mRSD-9多抗為本實(shí)驗(yàn)室制備。Flag和Myc單抗、Anti-Flag M2 Agrose購自Sigma。FITC和TRITC標(biāo)記的抗小鼠IgG購自中衫生物技術(shù)公司。

    1.5 工具酶及試劑 DL2000 DNA marker、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶Klenow片段、RNase A以及各種限制性內(nèi)切酶均為TaKaRa(大連)有限公司產(chǎn)品。IPTG和 X-gal購自Boehringer-mannheim;丙烯酰胺、N',N'- 亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、SDS等均購自Bio-Rad;Tris和尿素等購自Gibco-BRL;各種蛋白酶抑制劑均為Sigma產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)所用的DMEM和RPMI-1640購自Gibco-BRL,胎牛血清購自HyClone。胰蛋白酶購自Gibco-BRL。小規(guī)模轉(zhuǎn)染所用Lipofectamine 2000購自Invitrogene。其它各種試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

    1.6 主要儀器及設(shè)備 冷凍高速離心機(jī)(Beckman)、Eppendorf臺(tái)式冷凍離心機(jī)、MilliQ Plus超純水系統(tǒng)(Millipore)、PCR 儀(MJ research Inc.)、蛋白質(zhì)垂直電泳儀(Bio-Rad)、酶標(biāo)儀(Bio-tech Instruments Inc.)、紫外觀測儀及照相系統(tǒng)(UVP Inc.)、熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)(Nikon)、激光共聚焦顯微鏡(LEICA,TCS NT)等。

    2 方法

    2.1 質(zhì)粒載體的構(gòu)建[2]用PCR擴(kuò)增mRSD-9及endophilin 3 cDNA序列,引物設(shè)計(jì)時(shí)在上、下游引物的5'端分別加上HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)及HindⅢ和EcoRⅤ酶切位點(diǎn)。引物見表1。首先將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T載體上,然后以相應(yīng)的酶進(jìn)行雙酶切,并經(jīng)瓊脂糖電泳和切膠回收后,連接到經(jīng)過相同酶切的pcDNA6-HisB載體中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

    表1 質(zhì)粒載體構(gòu)建所使用的引物Table 1.The primers of plasmid vectors

    2.2 免疫共沉淀[3]磷酸鈣法轉(zhuǎn)染(1)pcDNA6/V5-Flag-endophilin3和pcDNA6/V5-HisB-Myc、(2)pcDNA6/V5-Flag-endophilin3和pcDNA6/V5-Myc-mRSD-9、(3)pcDNA6-HisB-Flag-endophilin3和pcDNA6/V5-HisB-Myc-mRSD-9于HEK 293T細(xì)胞;24 h后收集細(xì)胞制備細(xì)胞裂解液。處理Anti-Flag M2 Affinity Gel,充分混勻立即取40 μL置于新的管中,6000 r/min離心30 s;0.5 mL PBS洗滌樹脂2次。取適量細(xì)胞裂解液(根據(jù)Input結(jié)果確定使用量)加入洗滌好的抗-Flag樹脂中,其間追加1次PMSF,4℃ 振搖8 h,1000 r/min離心30 s棄去上清。隨后用3種洗液各洗1次后,棄上清。加入 30 μL 1.2 ×loading buffer,煮沸8 min,12000 r/min離心2 min后保留上清,-20℃保存?zhèn)溆?進(jìn)行15%和10%SDS-PAGE,然后用小鼠源抗Flag或者myc抗體作為I抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為II抗,ECL顯色。

    2.3 轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)[4]Lipofectamine 2000方法瞬轉(zhuǎn)pDsRed1-N1空質(zhì)粒、pDsRed1-N1-mRSD-9及pDsRed1-N1-ΔmRSD-9于HeLa細(xì)胞,6 h換液后正常培養(yǎng)12 h,然后換成無血清培養(yǎng)10h,再換成含25 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白的含血清的DMEM培養(yǎng)15 min,最后用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞,并用冰冷的4%多聚甲醛固定,顯微鏡觀察。

    穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-N1、pEGFP-N1- mRSD-9及pEGFP-N1-ΔmRSD-9的CHO細(xì)胞,37℃無血清培養(yǎng)1 h,然后換成含30 mg/L Texas red偶聯(lián)的轉(zhuǎn)鐵蛋白的DMEM 37℃培養(yǎng)1 h。

    2.4 ATP/GTP結(jié)合及競爭實(shí)驗(yàn)[5]mRSD-9蛋白和突變mRSD-9蛋白用BCA法測定蛋白濃度,將2種蛋白樣品分別上樣50-70 μg,于10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳。電泳后立即將膠置于含20%甘油的50 mmol/L Tris-HCl中浸泡洗滌2次,每次15 min。電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,30 V、3.5 h進(jìn)行電泳。用TBS洗3次,每次10 min后在封閉液中4℃封閉過夜或室溫20 min。再用結(jié)合緩沖液洗2遍(每次10 min)后進(jìn)行雜交。最后用結(jié)合緩沖液洗滌3次,每次10 min并進(jìn)行放射性自顯影。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    結(jié) 果

    1 mRSD-9與endophilin 3相互作用

    為了驗(yàn)證二者的相互作用,我們分別構(gòu)建了pcDNA6-HisB-Myc-mRSD-9和pcDNA6-HisB-Flag-endophilin 3的真核表達(dá)質(zhì)粒,并共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,從正反兩個(gè)方向?qū)Χ叩南嗷プ饔眠M(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示過量表達(dá)的Myc-mRSD-9能被Flag-endophilin 3共沉淀,見圖1A。反之,過表達(dá)的Flag-endophilin 3也能被Myc-mRSD-9共沉淀,見圖1B。說明這兩種蛋白能夠在體內(nèi)相互作用。

    Figure 1.The interactions mRSD - 9 and endophilin 3.A:co-immunoprecipitation of mRSD -9 with the endophilin 3.293T cells were co-transfected with the plasmids of Flag-endophilin 3 and Myc-mRSD-9.Anti-Flag M2 beads were used to pull down the transfected Flag-endophilin 3.Immunoprecipitates were examined for the presence of Myc-mRSD-9 using anti-Myc antibody.4%of the input is shown.B:anti-Myc antibody was used to pull down the transfected Myc-mRSD -9.The Flag-endophilin 3 in immunoprecipitates was examined by anti-Flag antibody.4%of the input is shown.Hc:heavy chain;Lc:light chain.C:co-localization of mRSD -9 and endophilin 3 visualized by laser confocal microscopy.CHO cells were cultured on glass coverslips and co-transfected with Myc-mRSD-9 and Flag-endophilin 3.Immunostaining was conducted using anti-Myc and anti-Flag as primary antibodies and FITC-conjugated and TRITC-conjugated antibodies as secondary antibodies.As control,CHO cells co-transfected with Myc-mRSD-9 and Flag vector or Flag-endophilin 3 and Myc vector showed no co-localization of the two components.圖1 mRSD-9與endophilin 3相互作用

    為了驗(yàn)證mRSD-9蛋白與endophilin 3蛋白在細(xì)胞內(nèi)是否相互作用,利用pEGFP-N1-mRSD-9融合綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)載體、pDsRed1-N1-endophilin 3融合紅色熒光蛋白(RFP)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,在激光共聚焦顯微鏡下觀察了mRSD-9-GFP融合蛋白與endophilin 3-RFP融合蛋白在CHO細(xì)胞中定位關(guān)系。結(jié)果顯示紅色熒光蛋白(endophilin 3)和綠色熒光蛋白(mRSD-9)在細(xì)胞中呈現(xiàn)完全共定位,見圖1C。

    2 mRSD-9促進(jìn)ATP/GTP轉(zhuǎn)化

    利用ExPASy-PROSITE網(wǎng)上資源進(jìn)行基序分析,發(fā)現(xiàn)mRSD-9蛋白具有P-loop基序結(jié)構(gòu),該基序可以參與ATP或GTP轉(zhuǎn)化。采用ExPASy-Prop-Search網(wǎng)上資源對(duì)mRSD-9氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)相似性比較。比對(duì)結(jié)果顯示mRSD-9蛋白與GrpE蛋白相似性最高。將分析結(jié)果用BioEdit生物分析軟件進(jìn)行驗(yàn)證,證明mRSD-9與ATP結(jié)合蛋白GrpE具有最大結(jié)構(gòu)相似性,見圖2A。因此采用[α-32P]-ATP/GTP blot overlay assay方法來研究它與ATP/GTP的結(jié)合。結(jié)果mRSD-9蛋白可以和ATP/GTP結(jié)合,而且它們的結(jié)合能被大于1000倍的高濃度非同位素標(biāo)記ATP/GTP所替代,因此結(jié)合是特異的,而且具有飽和性。為了驗(yàn)證mRSD-9 P-loop基序在ATP/GTP結(jié)合中的關(guān)鍵作用,我們構(gòu)建了P-Loop基序突變的ΔmRSD-9,并進(jìn)行了ΔmRSD-9的ATP/GTP結(jié)合實(shí)驗(yàn),見圖2B、C,結(jié)果表明P-loop基序是mRSD-9結(jié)合ATP/GTP的關(guān)鍵部分。

    Figure 2.mRSD -9 protein is structurally related to GrpE,which serves as an ADP/ATP exchange factor.A:the similarity score between mRSD -9 and GrpE was 0.32.The threshold value of similarity significance is 3.0,so the result indicates a significantly close structural similarity between these two proteins.B:mRSD-9 mutated by PCR-based site-directed mutagenesis.Lysine at position 141 within the conserved region of mRSD -9 P-loop mutated to aspartate,confirmed by sequencing.C:[α -32P]-ATP/GTP blot overlay assay.Lane 1:mRSD -9 incubated with[α -32P]ATP/GTP;Lane 2:mRSD-9 incubated with[α -32P]ATP/GTP and cold ATP/GTP;Lane 3:ΔmRSD -9 incubated with[α -32P]ATP/GTP;Lane 4:ΔmRSD-9 incubated with[α -32P]- ATP/GTP and cold ATP/GTP.圖2 mRSD-9促進(jìn)ATP/GTP轉(zhuǎn)化

    3 mRSD-9蛋白參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過程

    mRSD-9蛋白與GrpE蛋白具有較高結(jié)構(gòu)相似性,GrpE蛋白參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞中網(wǎng)格蛋白的釋放,所以考慮mRSD-9蛋白可能是通過影響內(nèi)吞過程中網(wǎng)格蛋白的釋放而影響了內(nèi)吞過程。

    通過轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)可見,在轉(zhuǎn)染空載體組,紅色熒光表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)鐵蛋白(綠色熒光)與周圍未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞大致相同,見圖3A。在轉(zhuǎn)染pDsRed1-N1-mRSD-9組,mRSD-9蛋白(紅色熒光)表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)鐵蛋白(綠色熒光)比周圍未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞明顯減少,見圖3B,說明mRSD-9蛋白抑制了轉(zhuǎn)鐵蛋白的內(nèi)吞。而在轉(zhuǎn)染pDsRed1-N1-ΔmRSD-9組,ΔmRSD-9蛋白(紅色熒光)表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)鐵蛋白(綠色熒光)比周圍未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞明顯增多,見圖3C,說明mRSD-9蛋白突變后不但對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞不具有抑制作用,還促進(jìn)了內(nèi)吞。

    Figure 3.Effect of overexpressed wild type or mutant mRSD-9 on the clathrin-dependent endocytosis.Transferrin uptake by HeLa or CHO cells was examined by confocal microscopy or flow cytometry.A:HeLa cells transfected with the expression plasmids encoding pDSRed-N1 empty vector,pDSRed-N1- mRSD-9 or pDSRed-N1-ΔmRSD-9 were incubated in serumfree media for 1 h at 37℃.After incubated with 30 mg/L FITC-transferrin for 1 h at 37℃,transferrin uptake was examined by laser confocal microscopy.Bar:20 μm.B:relative intensity of fluorescence.CHO cells stably transfected with pEGFP-N1-mRSD-9 or pEGFP-N1-ΔmRSD-9 were incubated in serum-free media for 1 h at 37℃.Cells were incubated with 30 mg/L Texas red-transferrin for 1 h at 37℃and examined by flow cytometry to determine uptake in 3×104cells..n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs EGFP group.圖3 mRSD-9蛋白對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞的影響

    討 論

    網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是一個(gè)多步驟多程序化的過程[6,7],隨著內(nèi)吞過程的引發(fā),網(wǎng)格蛋白聚集在膜上受體與配體結(jié)合部位的胞質(zhì)側(cè)而形成斑塊,并使細(xì)胞膜出現(xiàn)輕微的弧度。此后,有外被的膜向胞質(zhì)側(cè)形成一個(gè)寬底凹陷。帶有外被的寬底凹陷進(jìn)一步向內(nèi)凹陷并形成一個(gè)狹窄的頸部,逐漸融合形成一個(gè)獨(dú)立的小泡,在發(fā)動(dòng)蛋白提供動(dòng)力的作用下,小泡從頸部斷開,形成了帶有外被的自由運(yùn)動(dòng)的囊泡,但這個(gè)階段只是短暫的。然后,囊泡的網(wǎng)格蛋白外被在熱休克同源蛋白(heat-shock cognate protein 70,Hsc70)的ATPase作用下發(fā)生解體,釋放的網(wǎng)格蛋白可返回細(xì)胞膜繼續(xù)介導(dǎo)下一輪內(nèi)吞。最后,脫去包被的內(nèi)吞小泡與早期內(nèi)體(early endosome)融合,隨著融合囊泡內(nèi)的pH值降低,受體與配體分離。由此可見,網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞是一個(gè)高效而有序的過程[8]。

    最初人們認(rèn)為在頸部融合過程中,發(fā)動(dòng)蛋白的GTPase的功能起促進(jìn)作用。但是最近一些研究結(jié)果挑戰(zhàn)了這一說法。因?yàn)榘l(fā)動(dòng)蛋白的GED(GTPase effecter domain)結(jié)構(gòu)域似乎在寡聚反應(yīng)中才會(huì)介導(dǎo)較強(qiáng)的GTPase活性。當(dāng)GED結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變導(dǎo)致聚集激活的GTPase活性被中斷時(shí),受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用反而增強(qiáng)了[9]。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GTPase活性并不是內(nèi)吞作用中的限速步驟。發(fā)動(dòng)蛋白可能是通過作用于下游效應(yīng)因子的GTP結(jié)合狀態(tài)來起作用的。最后一個(gè)階段即是形成一個(gè)帶有外被的自由運(yùn)動(dòng)的囊泡。到目前為止還不能對(duì)脫離細(xì)胞膜后的內(nèi)吞小泡進(jìn)行確切追蹤。因?yàn)閹в型獗坏淖杂蛇\(yùn)動(dòng)的囊泡在刺激突觸后仍然很少見,所以可以推測外被的解聚過程是迅速發(fā)生的。網(wǎng)格蛋白外被的解聚與解聚 ATP酶Hsc70和輔助蛋白 auxilin的功能相關(guān)[10,11]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在 GTP轉(zhuǎn)換蛋白缺乏小鼠的胞質(zhì)中外被形成比在野生型小鼠胞質(zhì)中更為有效。

    在原核生物大腸桿菌中網(wǎng)格蛋白的釋放有賴于DnaK/DnaJ/GrpE分子伴侶系統(tǒng)。DnaJ上有2個(gè)結(jié)構(gòu)域,一個(gè)結(jié)合內(nèi)吞小泡上的網(wǎng)格蛋白,另一個(gè)結(jié)合DnaK。因此DnaK通過DnaJ與網(wǎng)格蛋白結(jié)合,并在DnaJ的催化下水解ATP為ADP,使網(wǎng)格蛋白從內(nèi)吞小泡上釋放下來。此時(shí)仍與ADP結(jié)合的DnaK對(duì)網(wǎng)格蛋白的結(jié)合能力較強(qiáng),需要GrpE的核苷酸交換作用,重新結(jié)合ATP后,DnaK才能與網(wǎng)格蛋白分離,完成網(wǎng)格蛋白的釋放[12]。

    GrpE核苷酸交換的具體機(jī)制是,GrpE形成同源二聚體,與DnaK的ATPase結(jié)構(gòu)域結(jié)合,通過引起后者的構(gòu)象變化,打開其ATPase結(jié)構(gòu)域核苷酸結(jié)合位點(diǎn),釋放 ADP,由于胞漿內(nèi)存在過量的 ATP,所以ATP進(jìn)入DnaK的ATPase結(jié)構(gòu)域,并將GrpE替換下來[13]。

    在真核細(xì)胞中,DnaK的同源物是Hsc70,一個(gè)在所有真核細(xì)胞胞漿中表達(dá)的組成性蛋白。DnaJ在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的同源物是GAK,即輔助蛋白2,它也是一個(gè)表達(dá)在所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞漿中的蛋白。由此推測GrpE在真核細(xì)胞胞漿中也應(yīng)該有一個(gè)對(duì)應(yīng)物,但目前僅發(fā)現(xiàn)它在線粒體中的同源物,而在胞漿中尚未發(fā)現(xiàn)。Mge1p存在于酵母(Saccharomyces cerevidiae)線粒體中,與GrpE功能相似,在從胞漿向線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中,起到核苷酸轉(zhuǎn)換的作用[14]。HMGE是在人線粒體中發(fā)現(xiàn)的GrpE同源蛋白,但是它不但不參與Hsc70系統(tǒng)的核苷酸轉(zhuǎn)換,而且還與DnaJ蛋白(HSJ1b)結(jié)合,抑制其催化 Hsc70的ATP酶作用[15]。

    mRSD-9蛋白含有保守的P-loop基序,文獻(xiàn)表明P-loop基序是一個(gè)ATP或GTP結(jié)合區(qū),參與某一耗能過程,提示mRSD-9蛋白可能通過該模序在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞中發(fā)揮重要作用。為了驗(yàn)證mRSD-9蛋白是否能夠與ATP或GTP結(jié)合,我們同時(shí)表達(dá)了mRSD-9蛋白和P-loop基序點(diǎn)突變的ΔmRSD-9蛋白,利用這兩種蛋白我們進(jìn)行了ATP和GTP結(jié)合實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明mRSD-9蛋白能夠與ATP/GTP可逆性結(jié)合,并且這種結(jié)合是由mRSD-9蛋白的P-loop結(jié)構(gòu)域所介導(dǎo)。據(jù)此,我們通過轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)研究mRSD-9蛋白是否參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞,采用ΔmRSD-9 K141D作為對(duì)照,發(fā)現(xiàn)mRSD-9通過P-loop區(qū)對(duì)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞具有抑制作用,而ΔmRSD-9顯著增加轉(zhuǎn)鐵蛋白的攝入。因?yàn)閑ndophilin3參與了網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞,并且有可能在內(nèi)吞晚期網(wǎng)格蛋白的釋放和早期內(nèi)吞小泡脫離細(xì)胞膜中都起作用。同時(shí)生物信息學(xué)研究也提示mRSD-9蛋白與GrpE蛋白具有較高結(jié)構(gòu)相似性,GrpE蛋白參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞中網(wǎng)格蛋白的釋放,所以考慮mRSD-9蛋白可能是通過影響內(nèi)吞過程中網(wǎng)格蛋白的釋放而影響了內(nèi)吞過程。

    當(dāng)然對(duì)這些機(jī)制的探討非常初步,mRSD-9是否通過促進(jìn)網(wǎng)格蛋白復(fù)合體的解體而促進(jìn)CCV的釋放也需要進(jìn)一步的研究。另外,對(duì)mRSD-9其它兩個(gè)結(jié)構(gòu)域-DPY30結(jié)構(gòu)域和Coiled-coil結(jié)構(gòu)域的功能還需要進(jìn)一步探討。

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